एक लार एंटीबॉडी मल्टीप्लेक्स Immunoassay का विकास पर्यावरण रोगजनकों के लिए मानव एक्सपोजर को मापने के लिए
Summary
In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.
Abstract
एटियलजि और पर्यावरण रोगजनकों के लिए मानव जोखिम के प्रभावों दुनिया भर में प्रमुख चिंता का विषय हैं और इस प्रकार, जोखिम और संक्रमण का उपयोग कर लागत प्रभावी, उच्च throughput दृष्टिकोण का आकलन करने की क्षमता अपरिहार्य होगा। इस पांडुलिपि के विकास और एक मनका-आधारित मल्टीप्लेक्स एक साथ कई रोगजनकों के लिए मानव लार में एंटीबॉडी की उपस्थिति को मापने में सक्षम प्रतिरक्षा के विश्लेषण का वर्णन है। क्योंकि यह noninvasive, सस्ता और सीरम से इकट्ठा करने के लिए आसान है लार इस आवेदन में विशेष रूप से आकर्षक है। पर्यावरण रोगजनकों से एंटीजन Carboxylated microspheres (मोती) के लिए मिलकर कर रहे थे और एक मनका आधारित, समाधान चरण परख का उपयोग मानव लार के नमूने की बहुत छोटी मात्रा में एंटीबॉडी को मापने के लिए इस्तेमाल किया। मोती कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी, हेलिकोबेक्टर, Toxoplasma gondii, noroviruses (जी I.1 और जी II.4) से एंटीजन और हेपेटाइटिस ए वायरस के साथ मिलकर कर रहे थे। यह सुनिश्चित करें कि एंटीजन पर्याप्त करने के लिए मिलकर कर रहे थेमोती, युग्मन प्रजातियों विशिष्ट, पशु व्युत्पन्न प्राथमिक कब्जा एंटीबॉडी का उपयोग कर पुष्टि की गई थी, biotinylated विरोधी प्रजातियों का पता लगाने माध्यमिक एंटीबॉडी और streptavidin-R-phycoerythrin रिपोर्टर (SAPE) के साथ ऊष्मायन द्वारा पीछा किया। एक नियंत्रण बाध्यकारी को मापने के लिए गैर विशिष्ट रूप में, एक मनका सेट दूसरों को हूबहू इलाज किया गया था सिवाय इसके कि यह किसी भी प्रतिजन के लिए युग्मित नहीं किया गया था। प्रतिजन मिलकर और नियंत्रण मोती तो भावी एकत्र मानव लार के नमूनों के साथ incubated रहे थे, एक उच्च throughput प्रवाह cytometry के सिद्धांतों पर आधारित विश्लेषक पर मापा जाता है, और प्रत्येक प्रतिजन के लिए एंटीबॉडी की उपस्थिति माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता इकाइयों में मापा गया था (एमएफआई) । इस मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा कम नमूने के साथ अधिक डेटा सहित लाभ के एक नंबर है; कम लागत और श्रम; और क्षमता के हित के कई ठिकानों को परख अनुकूलित करने के लिए। परिणाम से संकेत मिलता है कि लार मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा पिछले जोखिम और संक्रमण की पहचान करने में सक्षम हो सकता है, हो सकता है जो especiaनिगरानी बड़ी मानव आबादी को शामिल अध्ययन में lly उपयोगी है।
Introduction
डायरिया से संबंधित बीमारी के अस्सी आठ प्रतिशत दुनिया भर में, दूषित पानी के लिए मानव जोखिम, असुरक्षित भोजन, और गरीब स्वच्छता / स्वच्छता के साथ जुड़ा हुआ है लगभग 1.5 लाख लोगों की मृत्यु का कारण बनता है, जिनमें से अधिकांश बच्चों 1 रहे हैं। यह सार्वजनिक स्वास्थ्य अधिकारियों और नीति निर्माताओं के लिए चिंता का एक प्रमुख कारण है। जोखिम और जलजनित और अन्य पर्यावरणीय रोगजनकों के साथ जुड़े बीमारियों की जांच करने के प्रयास में, हम मानव नमूने 2-4 में एंटीबॉडी को मापने के लिए एक मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा विकसित की है। इस विधि इन रोगजनकों के लिए मानव जोखिम का निर्धारण करने के लिए और बेहतर immunoprevalence और घटना के संक्रमण को परिभाषित करने के महामारी विज्ञान के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है।
लार एक वैकल्पिक मानव बायोमार्कर अनुसंधान के लिए सीरम के रूप में काफी संभावनाएं हैं। लार का उपयोग कर के फायदे के अलावा गैर invasiveness और नमूना संग्रह, कम लागत में आसानी रहे हैं, और नमूने आसानी से बच्चों 5-7 <से एकत्र किया जा सकता है/ Sup>। सीरम और लार के नमूने एच के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है पाइलोरी 2,3,8, प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम 9, एटामोइबा हिस्टोलिटिका 10, Cryptosporidium parvum 3,11, स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया 12, हेपेटाइटिस वायरस ए और सी 13-14, noroviruses 2-4,15, टी gondii 2-4, डेंगू वायरस 16, मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) 17, और कोलाई O157: H7 18।
एक मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा एक साथ एक ही नमूना मात्रा के भीतर और एक एकल चक्र या चलाने के भीतर कई analytes के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। सी से मल्टिप्लेक्स एंटीजन जेजुनी, टी gondii, एच पाइलोरी, हेपेटाइटिस ए वायरस, और दो noroviruses इनमें से एक का उपयोग कर रोगजनकों के लिए मानव लार आईजीजी 2-4 और आईजी ऐ 3,4 और प्लाज्मा आईजीजी 2,3 प्रतिरक्षी प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया गयामनका-आधारित बहुसंकेतन प्रतिरक्षा। जब पानी, मिट्टी और भोजन में रोगाणुओं के लिए जोखिम के महामारी विज्ञान के अध्ययन के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, परख के प्रकार के इस अध्ययन में वर्णित बहुमूल्य जानकारी पर्यावरण रोगजनकों की वजह से संक्रमण की समझ बढ़ाने के लिए प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, लार एंटीबॉडी इस तरह के अध्ययन से प्राप्त आंकड़ों जोखिम मूल्यांकन मॉडल 19-22 सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन परिणामों से संकेत मिलता है कि मल्टीप्लेक्स प्रतिरक्षा विधि लार के नमूने है कि immunopositive या immunonegative के बीच भेदभाव करने के लिए उपयोगी है। immunopositivity का निर्धारण करने के लिए, एक भी कट ऑफ बिंदु मतलब प्लस नियंत्रण uncou…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.
Materials
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387 : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori : lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni : heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ) | KPL | 16-10-02 | Used for Salivary Immunoassay |
| Consumables | |||
| 1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1000 µL pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
References
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. . Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , (2008).
- Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
- Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
- Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
- Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
- Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
- Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
- Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
- Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
- Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
- Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
- Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
- Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
- Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
- Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
- Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046 (2011).
- Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
- Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
- Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
- Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
- Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
- Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
- Wade, T. J., et al. . Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
- Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
- Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
- Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
- Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
- Clotilde, L., Bernard, C., Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
- . . Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
- Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).
