El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales
Summary
In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.
Abstract
La etiología y los efectos de la exposición humana a los patógenos ambientales son de gran preocupación en todo el mundo y, por lo tanto, la capacidad para evaluar la exposición y las infecciones de costos, utilizando métodos eficaces de alto rendimiento sería indispensable. Este manuscrito describe el desarrollo y análisis de un inmunoensayo basado en perlas multiplex capaz de medir la presencia de anticuerpos en la saliva humana a múltiples patógenos simultáneamente. La saliva es particularmente atractivo en esta aplicación, ya que no es invasiva, más barato y más fácil de recoger que el suero. Antígenos de patógenos ambientales fueron acoplados a microesferas carboxiladas (perlas) y se utilizan para medir los anticuerpos en volúmenes muy pequeños de muestras de saliva humanos utilizando un ensayo basado en perlas, solución de fase. Las bolas se acoplan con antígenos de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G y G I.1 II.4) y virus de hepatitis A. Para asegurarse de que los antígenos se acoplan a suficientementelas perlas, el acoplamiento se confirmó utilizando especies específicas, anticuerpos de captura primaria de origen animal, seguido de incubación con biotina anti-anticuerpos de detección de especies secundarias y reportero de estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Como control para medir la unión no específica, un conjunto de microesferas se trató de forma idéntica a los otros excepto que no se acopló a cualquier antígeno. Las perlas de antígeno acoplado y de control se incubaron con muestras de saliva humanos recogidos prospectivamente-, medido en un analizador de alto rendimiento basado en los principios de la citometría de flujo, y la presencia de anticuerpos frente a cada antígeno se midió en unidades de intensidad mediana de fluorescencia (MFI) . Este inmunoensayo multiplex tiene una serie de ventajas, incluyendo más datos con menos de la muestra; reducción de los costes y mano de obra; y la capacidad de personalizar el ensayo para muchas dianas de interés. Los resultados indican que el inmunoensayo múltiplex salival puede ser capaz de identificar las exposiciones y las infecciones anteriores, que puede ser especiaLLY útil en estudios de vigilancia que involucran grandes poblaciones humanas.
Introduction
Ochenta y ocho por ciento de las enfermedades relacionadas con la diarrea todo el mundo se asocia con la exposición humana a agua contaminada, los alimentos insalubres, y la falta de saneamiento / higiene, causando aproximadamente 1,5 millones de muertes, la mayoría de los cuales son niños 1. Esta es una de las principales causas de preocupación para los funcionarios de salud pública y los responsables políticos. En un esfuerzo por investigar exposiciones y enfermedades asociadas con la navegación y otros patógenos ambientales, hemos desarrollado un inmunoensayo múltiplex para medir los anticuerpos en muestras humanas 2-4. Este método se puede aplicar a los estudios epidemiológicos para determinar la exposición humana a estos patógenos y definir mejor las infecciones immunoprevalence e incidentes.
La saliva es muy prometedora como una alternativa al suero para la investigación de biomarcadores humanos. Entre las ventajas de usar saliva son la no invasividad y la facilidad de la recogida de muestras, bajo coste, y las muestras pueden ser fácilmente recogidos de los niños de 5-7 </ Sup>. Las muestras de suero y saliva se han estudiado ampliamente para anticuerpos contra H. pylori 2,3,8, 9 Plasmodium falciparum, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumoniae 12, virus de la hepatitis A y C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, virus dengue 16, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 17, y Escherichia coli O157: H7 18.
Un inmunoensayo multiplex permite el análisis de múltiples analitos simultáneamente dentro de un solo volumen de muestra y dentro de un solo ciclo o correr. Antígenos de C. multiplexados jejuni, T. gondii, H. pylori, hepatitis A virus, y dos norovirus se utilizaron para medir humano salival IgG e IgA 2-4 3,4 y respuestas de anticuerpos de IgG en plasma de 2,3 a estos patógenos utilizando unabasado en perlas inmunoensayo multiplexación. Cuando se utiliza en conjunción con estudios epidemiológicos de la exposición a microbios en el agua, el suelo y los alimentos, del tipo de ensayo descrito en este estudio puede proporcionar información valiosa para mejorar la comprensión de las infecciones causadas por patógenos ambientales. Además, los datos de anticuerpos salivales obtenidos de tales estudios se pueden usar para mejorar los modelos de evaluación de riesgos 19-22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estos resultados indican que el método de inmunoensayo multiplex es útil para discriminar entre muestras de saliva que son immunopositive o immunonegative. Para determinar immunopositivity, un solo punto de corte fue desarrollado por el cálculo de la media más tres desviaciones estándar de las respuestas de registro transformado IFM de las perlas no acoplados de control probados con todas las muestras de saliva. El punto de corte concede la capacidad de evaluar la exposición y immunoprevalence ya sea a solas o mú…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.
Materials
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387 : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori : lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni : heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ) | KPL | 16-10-02 | Used for Salivary Immunoassay |
| Consumables | |||
| 1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1000 µL pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
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