Utveckla en spott Antibody Multiplex immun att mäta människors exponering för miljö Pathogens
Summary
In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.
Abstract
Etiologi och konsekvenser av människors exponering för miljö patogener är ett stort bekymmer i världen och därmed skulle förmåga att bedöma exponering och infektioner med hjälp av kostnadseffektiva, hög genomströmning tillvägagångssätt vara nödvändigt. Detta manuskript beskriver utvecklingen och analys av en sträng-baserade multiplex immun kan mäta förekomsten av antikroppar i mänsklig saliv till flera patogener samtidigt. Saliv är särskilt attraktiv i denna tillämpning eftersom den är icke-invasiv, billigare och lättare att samla än serum. Antigener från miljömässiga patogener kopplades till karboxylerade mikrosfärer (pärlor) och användes för att mäta antikroppar i mycket små volymer av humana salivprover med användning av en pärla-baserade, assay lösningsfas. Pärlor kopplades med antigener från Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G I.1 och G II.4) och hepatit A-virus. För att säkerställa att antigenerna tillräckligt kopplades tillpärlorna var koppling bekräftas med artspecifika, animaliska primärinfångningsantikroppar, följt av inkubation med biotinylerade anti-arter sekundära antikroppar upptäckt och streptavidin-R-fykoerytrin reporter (SAPE). Som en kontroll för att mäta icke-specifik bindning, var en pärla uppsättning behandlades identiskt med de andra förutom att det inte kopplades till varje antigen. De antigenkopplade och kontrollpärlor inkuberades sedan med prospektivt-uppsamlade humana salivprover, mätt på en hög genomströmning analysator baserat på principerna för flödescytometri, och närvaron av antikroppar mot varje antigen mättes i Median Fluorescence Intensity heter (MFI) . Denna multiplex immun har ett antal fördelar, inklusive mer data med mindre prov; minskade kostnader och arbete; och förmågan att anpassa analysen till många mål av intresse. Resultaten tyder på att saliv multiplex immun kan vara i stånd att identifiera tidigare exponeringar och infektioner, som kan vara especially användbar i övervakningsstudier med stora befolkningsgrupper.
Introduction
Åttioåtta procent av diarré relaterad sjukdom i världen förknippas med exponering för förorenat vatten, osäkra mat och dåliga sanitära förhållanden / hygien, vilket cirka 1,5 miljoner dödsfall, varav de flesta är barn 1. Detta är en viktig orsak till oro för folkhälsan tjänstemän och beslutsfattare. I ett försök att undersöka exponeringar och sjukdomar som förknippas med vattenburna och andra miljö patogener, har vi utvecklat en multiplex immun att mäta antikroppar i humana prover 2-4. Denna metod kan tillämpas på epidemiologiska studier för att bestämma människors exponering för dessa patogener och för att bättre definiera immunoprevalence och incident infektioner.
Saliv innehåller mycket lovande som ett alternativ till serum för mänskliga biomarkör forskning. Bland fördelarna med att använda saliv är den icke-invasiv och enkel provuppsamling, låg kostnad, och prover kan enkelt samlas in från barn 5-7 </ Sup>. Serum- och salivprov har studerats ingående med avseende på antikroppar mot H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumoni 12, hepatitvirus A och C 13-14, norovirus 2-4,15, T. gondii 2-4, dengue-virus 16, humant immunbristvirus (HIV) 17, och Escherichia coli O157: H7 18.
En multiplex immunoanalys möjliggör analys av flera analyter samtidigt i en enda provvolym och inom en enda cykel eller springa. Multiplexade antigener från C. jejuni, T. gondii, H. pylori, var hepatit A-virus, och två norovirus används för att mäta mänsklig saliv IgG 2-4 och IgA 3,4 och plasma-IgG 2,3 antikroppssvar till dessa patogener med hjälp av enbead baserade multiplexering immunoanalys. När den används tillsammans med epidemiologiska studier av exponering för mikrober i vatten, jord och mat, kan typen av analys som beskrivs i denna studie ge värdefull information för att öka förståelsen av infektioner orsakade av miljömässiga patogener. Dessutom kan salivantikropps data som erhållits från sådana studier kan användas för att förbättra riskbedömningsmodeller 19-22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dessa resultat indikerar att multiplex immunoassay metod är användbar för att skilja mellan salivprover som är immunpositiva eller immunonegative. För att bestämma immunopositivity var en enda brytpunkt utvecklats genom att beräkna medelvärdet plus tre standardavvikelser av log transformerade MFI svar kontroll okopplade pärlor testats med alla salivprov. Cut-off gav förmåga att bedöma exponering och immunoprevalence till antingen en enda eller flera patogener. Denna diskriminerande makt kan vara användbar i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clarissa Curioso was supported through an appointment to the Research Participation Program at the U.S. Environmental Protection Agency administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education through an interagency agreement between the U.S. Department of Energy and U.S. EPA.
Materials
| Equipment and Software | |||
| Microcentrifuge | Thermo Electron Corporation | 75002446 | Used to centrifuge samples |
| Vortex Mixer | VWR | G560 | Used to mix samples |
| Sonicator (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Used to separate beads |
| Pipettors P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Various | |
| Hemacytometer (Bright Line) | Housser Scientific | 3200 | Used to count coupled beads |
| Multiscreen Vacuum Manifold | Millipore | MSVMHTS00 | Used in washing steps to remove supernatant |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Used to agitate beads during incubations |
| Tube rack (1.5mL and 0.5mL) (assorted) | VWR | 30128-346 | |
| Weighing Scale | Mettler or other | Used to measure wash reagents for making buffers | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Used during coupling incubation step |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Used to analyze antibody response data | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Used to analyze antibody response data | |
| Luminex Analyzer with xPonent 3.1 software | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Instrument and software used to run assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Norwalk Virus : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387 : p-particle | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Childrens' Hospital. Final conc. 5 µg. |
| Hepatitis A Virus : grade II concentrate from cell culture | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigen coupled at 100 µg |
| Helicobacter pylori : lysate | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigen coupled at 25 µg |
| Toxoplasma gondii : recombinant p30 (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigen coupled at 25 µg |
| Campylobacter jejuni : heat killed whole cells | KPL | 50-92-93 | Antigen coupled at 50 µg |
| Primary Antibodies | |||
| Guinea pig anti-Norovirus | (CCHMC)* | NA | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| Mouse anti-Hepatitis A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Used for coupling confirmation |
| BacTraceAffinity Purified Antibody to Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Used for coupling confirmation |
| Goat pAb to Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Used for coupling confirmation |
| BacTrace Goat anti-Campylobacter species | KPL | 01-92-93 | Used for coupling confirmation |
| Secondary Antibodies | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Used for coupling confirmation |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | KPL | 176-1506 | Used for coupling confirmation |
| Affinity Purified Antibody Biotin Labeled Goat anti-Human IgG(ᵞ) | KPL | 16-10-02 | Used for Salivary Immunoassay |
| Consumables | |||
| 1.5 mL copolymer microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1415-2500 | Used as low binding microcentrifuge tubes |
| 10 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µL pipette tip refills | BioVentures | 5030080C | |
| 1000 µL pipette tip refills | BioVentures | 5130140C | |
| Aluminum foil | Various Vendors | Used keep beads in the dark during incubations | |
| Deep Well plates | VWR | 40002-009 | Used for diluting saliva samples |
| Multiscreen Filter Plates | Millipore | MABVN1250 | Used to run assays |
| Oracol saliva collection system | Malvern Medical Developments Limited | Used for saliva collection | |
| Reagents | |||
| Carboxylated microspheres (beads) | Luminex Corporation | Dependent on bead set | Antigens are coupled to the microspheres |
| EDC (1-ethyl-3-[3dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) | Pierce | 77149 or 22980 | Used in bead activation |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Used in bead activation |
| Steptavidin-R-phycoerythrin (1mg/mL) | Molecular Probes | S-866 | Used as reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | M-2933 | Used for coupling |
| Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan monolaurate) | Sigma | P-9416 | Used in wash buffer to remove non-specific binding |
| Protein Buffers | |||
| PBS-TBN Blocking/ Storage Buffer (PBS, 0.1% BSA, 0.02% Tween-20, 0.05% Azide, pH 7.4)** | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl |
| BSA | Sigma | A-7888 | 0.1% (w/v) |
| Tween-20 | Sigma | P-9416 | 0.2% (v/v) |
| Sodium Azide (0.05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Caution: Sodium azide is acutely toxic. Avoid contact with skin and eyes. Wear appropriate PPE's. Dispose of according to applicable laws. |
| MES/ Coupling Buffer (0.05 M MES, pH 5.0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7.4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| NaH2PO4 (Sodium phosphate, monobasic anhydrous) | Sigma | S-3139 | 0.1M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4) | Filter Sterilize and store at 4°C | ||
| PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% TWEEN |
References
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. . Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , (2008).
- Augustine, S., et al. Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens. J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).
- Griffin, S., et al. Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers. J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).
- Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens. J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).
- Ferguson, D. Current diagnostic uses of saliva. J Dent Res. 66, 420-424 (1987).
- Mandel, I. The diagnostic uses of saliva. J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).
- Malamud, D. Saliva as a Diagnostic Fluid. Brit Med J. 305, 207-208 (1992).
- Ballam, L., et al. Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection. J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).
- Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum. Malar J. 10, 104 (2011).
- Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies. J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).
- Toyoguchi, A., et al. Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection. J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).
- Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants. J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).
- Tourinho, R., et al. Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay. J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).
- Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies. Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).
- Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).
- Yap, G., Sil, B., Ng, L. Use of saliva for early dengue diagnosis. PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046 (2011).
- Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus. Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).
- Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS. J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).
- Ashbolt, N., Bruno, M. Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia. J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).
- Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse. Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).
- Ashbolt, N. Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).
- Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids. Risk Anal. 24, 221-236 (2004).
- Wade, T. J., et al. . Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011. , (2011).
- Fujii, Y., et al. Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models. PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040 (2014).
- Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model. Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).
- Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century. Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).
- Baughman, A., et al. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).
- Clotilde, L., Bernard, C., Hartman, G., Lau, D., Carter, J. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods. J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).
- . . Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2. 3, 6-102 (2014).
- Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays. J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).
