Determinação das espécies e quantificação de misturas utilizando MRM Espectrometria de Massa de peptídeos Aplicada à autenticação Meat

Summary

We present a protocol for identifying and quantifying the components in mixtures of species possessing similar proteins. Mass spectrometry detects peptides for identification, and gives relative quantitation by ratios of peak areas. As a tool food for fraud detection, the method can detect 1% horse in beef.

Abstract

We describe a simple protocol for identifying and quantifying the two components in binary mixtures of species possessing one or more similar proteins. Central to the method is the identification of ‘corresponding proteins’ in the species of interest, in other words proteins that are nominally the same but possess species-specific sequence differences. When subject to proteolysis, corresponding proteins will give rise to some peptides which are likewise similar but with species-specific variants. These are ‘corresponding peptides’. Species-specific peptides can be used as markers for species determination, while pairs of corresponding peptides permit relative quantitation of two species in a mixture. The peptides are detected using multiple reaction monitoring (MRM) mass spectrometry, a highly specific technique that enables peptide-based species determination even in complex systems. In addition, the ratio of MRM peak areas deriving from corresponding peptides supports relative quantitation. Since corresponding proteins and peptides will, in the main, behave similarly in both processing and in experimental extraction and sample preparation, the relative quantitation should remain comparatively robust. In addition, this approach does not need the standards and calibrations required by absolute quantitation methods. The protocol is described in the context of red meats, which have convenient corresponding proteins in the form of their respective myoglobins. This application is relevant to food fraud detection: the method can detect 1% weight for weight of horse meat in beef. The corresponding protein, corresponding peptide (CPCP) relative quantitation using MRM peak area ratios gives good estimates of the weight for weight composition of a horse plus beef mixture.

Introduction

The European horse meat scandal of 2013, in which undeclared horse meat was found in a number of supermarket beef products¹, highlights the need for testing methods capable of detecting and measuring food fraud in meat. Several technologies have been explored, especially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and DNA-based methods². An alternative route, based on mass spectrometry, targets species-specific peptides which in turn arise from species-specific proteins. Here we outline one such peptide-based approach that offers both identification and relative quantitation of the adulterant species in a meat mixture³.

The protocol is framed in the context of red meats and the desire to determine the presence of one in another at the level of 1% by weight, the level considered by some to represent fraudulent food adulteration as opposed to contamination⁴. The method relies in the first instance on identifying a protein which is nominally ‘the same’ in all target meats. Myoglobin, the protein responsible for the red color of meat, is a good candidate since it is abundant, relatively heat tolerant and water soluble, and has been used for species determination of meat previously^5,6. The myoglobins for beef (Bos Taurus), pork (Sus scrofa), horse (Equus caballus) and lamb (Ovis aries)³, for instance, are nominally the same, as required, but their sequences are not identical. Such groups of ‘similar but different’ proteins, like these four myoglobins, can conveniently be described as ‘corresponding proteins’. The sequence differences in these four myoglobins are species-specific: for example, the full myoglobin proteins for beef and horse, P02192 and P68082 respectively, each comprise 154 amino acids with 18 sequence differences between the two. Subject to proteolysis using trypsin these proteins produce two sets of peptides, some of which are identical, and some which show one or more species-specific amino acid differences: corresponding proteins therefore give rise to corresponding peptides.

The CPCP approach, therefore, seeks first to identify proteins from two or more species where these proteins exhibit limited species-specific sequence variants. These are corresponding proteins. Following proteolysis, corresponding proteins give rise to peptides, some of which likewise display species-specific sequence variants inherited from the parent protein. These are corresponding peptides. The CPCP approach can be used to compare levels of two corresponding proteins in a mixed species sample by monitoring the levels of corresponding peptides.

The natural technology for the detection of known peptides is multiple reaction monitoring mass spectrometry, or MRM-MS⁷. Species-specific peptides yield precursor ions, which along with their mass spectrometry fragment ions, are easily itemized in advance by software tools. These lists are then used to instruct the mass spectrometer to record only specific precursor plus fragment ion pairs, called transitions. A particular target peptide is therefore identified not only by its retention time in the chromatography preceding the mass spectrometer, but also by a set of transitions sharing a common precursor ion. This is a highly selective means of detecting known peptides that makes efficient use of the mass spectrometer resource.

Other authors have used mass spectrometry to test for meat adulteration via peptide markers but from disparate proteins^8-14. Using the corresponding proteins, corresponding peptides (CPCP) scheme, however, means experimental conditions can be optimized, aiding identification of the species in the mixture from known species-specific transitions. In addition, corresponding proteins and peptides will generally behave similarly in the extraction, proteolysis and detection stages. Since transition peak areas are quantitative and reproducible, ratios of peak areas arising from pairs of corresponding peptides from different species provide a direct estimate of the relative quantities of two meats in a mixture. In contrast, more traditional quantitation routes exploit calibrations based on reference materials to establish absolute quantitation^14,15.

Though the protocol is outlined in the context of myoglobin and meat, proteins other than myoglobin could be used for identification and relative quantitation via the CPCP strategy in meat mixtures, though potentially with modifications to the protocol. In addition the strategy is also applicable to binary mixtures of other species sharing one or more corresponding proteins.

The starting point for the protocol is purified ‘reference’ myoglobin, which for some species can be purchased but which for others must be prepared by conventional size-exclusion chromatography. The procedure for preparing reference myoglobin is not included in the protocol, but is described elsewhere³. Software tools¹⁶ are used to list candidate peptides and transitions arising from myoglobins of interest. Each reference myoglobin is subjected to proteolysis and the resultant peptides analyzed by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) to discover which of the candidate precursor ions and transitions are most useful, and to determine the matching peptide retention times. The outcome of this stage is a revised list of target peptides with their transitions, suitable for species determination, and a list of CPCP pairs, suitable for relative quantitation. To test real meats, sample extractions are prepared then subjected to proteolysis to generate peptides both from myoglobin and other extraneous proteins. The myoglobin-based peptides are then monitored by LC-ESI-MS/MS based on their listed transitions. The species present in a mixture are identified by the transition peaks associated with marker peptides. Estimates of the relative amounts of two meats in a binary mixture are calculated using ratios of transition peak areas. A set of test mixtures of pairs of meats will allow the ratio of peak areas for a given pair of transitions to be checked and calibrated against actual mixtures.

Protocol

1. A proteólise e Análise de Referência mioglobinas A proteólise de referência mioglobinas Preparar soluções de referência as mioglobinas purificadas (intervalo de 0,2-0,5 mg / ml em bicarbonato de amónio 25 mM) 3. Transferir alíquotas de 1 ml de cada amostra para tubos de centrífuga de 2 ml. Termicamente desnaturar as proteínas extraídas por aquecimento da amostra num bloco quente a 95 ° C durante 30 min. Arrefece-se a amostra durante aproximadamente 15 min, até atingir a temperatura ambiente. Adicionar 30 mg de ureia (concentração final 0,5 M) para melhorar a digestão, em seguida homogeneizar. proteólise tríptico Prepara-se uma solução de 1 mg / ml de tripsina em bicarbonato de amónio 25 mM e armazenar em gelo conforme necessário. Adicionar um volume suficiente de tripsina de modo a que a actividade final da enzima é de 420 BAEE (benzoil-L-arginina N-acetato de cloridrato do éster) unidades / mg de proteína extraída, em seguida, misturar em vortex suave e permitir a proteolyze durante a noite a 37 ° C. Realizar dodecil de sódio eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 17 para demonstrar a integridade da proteólise. Dessalinização da amostra pós-proteólise Dilui-se a amostra 1: 2 v: v de água. Activa um de fase inversa polimérico (RP) do cartucho cheio com material de RP de 30 mg por adição de 1 ml de metanol, em seguida equilibrar o cartucho através da adição de 1 ml de 1% de ácido fórmico. Carregar a amostra para o cartucho sob a gravidade. Lava-se com 1 ml de ácido fórmico a 5% de metanol / 1% sob a gravidade. Elui-se os péptidos com 1 ml de acetonitrilo / água (90:10 v: v; 0,1% de ácido fórmico) sob gravidade em 2 ml de tubos de microcentrífuga pré-preenchido com 5 ul de dimetilsulfóxido (DMSO). Remover o solvente sob vácuo a 50 ° C utilizando um evaporador centrífugo durante 120 min, em seguida, redissolver o resíduo em 250 ul de acetonitrilo / água (3:97, v: v; 0,1% de ácido fórmico). Transferira solução para um volume baixo auto amostrador frasco. Nota: As amostras podem ser armazenadas a 4 ° C até estar pronto para espectrometria de massa de análise de cromatografia líquida (LC / MS). Geração de listas de transição para MRM Localize as sequências de mioglobina para as diferentes carnes do banco de dados UniProt. Digite as sequências de mioglobina na caixa de 'Target' do software de previsão de péptidos e de transição (por exemplo, Horizonte). Se necessário, passar o mouse sobre um peptídeo para revelar a sua lista de fragmento. Clique em "Configurações" e selecione "Peptide Configurações '. Entrada as preferências para a digestão (isto é, tripsina) e o número de clivagens perdidas (0). Introduza a selecção pretendida para os parâmetros adicionais, em particular, o comprimento do péptido (6-25), exclusões de terminal-N (0) e assumiu modificações de aminoácidos (nenhum). Clique em "Configurações" e selecione "Configurações de transição". Selecione as preferências parao tipo de aparelho utilizado para a análise por LC / MS. Clique em "Export" e selecione "Lista de Transição" para criar uma planilha contendo as transições de MRM gerados e parâmetros. Análise por LC / MS Defina-se um sistema de gradiente binário (água (A) e acetonitrilo (B), cada uma com 0,1% de ácido fórmico, v: v) cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com automático de amostras, a coluna central do escudo de HPLC C18 (10 cm x 2,1 mm , 2,6? M de tamanho de partícula) ligado a um espectrómetro de massa de triplo quadrupolo operado no modo de electrospray positivo com detecção MRM. No software de coleta de dados (por exemplo, Analyst), selecione 'File' e 'New' e clique em 'método de aquisição "na caixa de pop-up, em seguida, clique em' OK '. Nota: Isso abre o editor de método de instrumento, que contém uma lista dos dispositivos conectados que permitirão a instalação de um novo método LC / MS. Clique em 'Binary Bomba' e iNput o valor da taxa de fluxo (300 ul / min) e os tempos de gradiente na tabela, estabelecendo um perfil de gradiente binário de 3% de B até 30% de B durante 22 min, aumentando para 100% de B em 23 min, durante 5 minutos de lavar antes de voltar às condições iniciais e re-equilíbrio durante mais 6 min. Clique em 'Autosampler "e insira o volume de injecção (5 mL). Ativar o "Needle ciclos de lavagem" e digite o "Wash Time '(30 seg) e selecione' Porto Resplendor '. Clique em "Controlador Coluna termostato 'e em' Coluna Forno Propriedades 'definir o' Temperature Esquerda" e "Temperatura Right '(40 ° C). Clique em 'Mass Spectrometer "e, em seguida, clique em' Editar Parâmetros" para introduzir as condições de gás de origem. Selecione a opção "Tipo de digitalização" como "MRM (MRM) 'eo' polaridade 'como' Positivo '. Ir para 'Resumo Período' e introduza o 'Tempo de Duração ", o tempo total para a análise de uma LCd de equilíbrio (35 minutos). Na tabela, clique direito e selecione "declustering potencial (DP)" e "Collision Energia (CP) 'para adicionar essas colunas para a tabela. Digite os Q1, Q3, Tempo (ms), ID, valores DP e CE para todas as transições, por uma única espécie de carne, criados na lista de transição (veja o passo 1.4.5). Nota: Tempo (mseg) refere-se ao tempo de espera, o tempo passa o espectrómetro de massa de varrimento de cada transição, o somatório de que não deverá exceder 3 seg. Salve o arquivo método de aquisição (arquivo de extensão .dam). Nota: Os passos 1.5.2 – 1.5.8 ter de ser repetido para cada espécie de carne. Isto irá criar um único arquivo método para cada espécie de carne no modo de tela em preparação para análise abaixo. No software de coleta de dados, clique em 'Adquirir' e selecione 'Equilibrar'. Na caixa que se abre, selecione o método de aquisição necessária para começar o equilíbrio instrumento. Coloque os frascos de amostra no arack no amostrador automático. Clique em "Arquivo" e selecione "Novo", em seguida, "a aquisição do lote '. No separador 'Sample' selecionar 'Adicionar Conjunto de' então 'Adicionar Amostras'. Insira o número de amostras a serem analisadas e clique em 'OK'. Na caixa "Aquisição" selecione o arquivo método que será utilizado para a análise do menu drop-down. Na tabela, selecione 'Código Placa' e selecione a configuração da bandeja apropriada a partir do menu suspenso. clique esquerdo no 'Placa Code' cabeçalho da coluna, em seguida, clique direito e selecione "Fill Down '. Em 'Vial Position' introduzir a posição de cada amostra no amostrador automático nas linhas. Em "Arquivo de Dados" introduzir o nome do arquivo para a aquisição, clique em seguida, à esquerda no cabeçalho da coluna seguido pelo botão direito e selecione "Fill Down '. Em 'Amostra Nome' inserir a identidade de cada uma das amostras a ser analisadas. Salvar como um arquivo de lote de aquisição (arquivo extension .dab). Clique na guia "Enviar", em seguida, destacar as amostras que precisam ser analisados ​​na LC / MS. Clique em "Enviar". Clique em 'Adquirir' e 'Iniciar Sample' para iniciar a análise. Nota: Cada método de aquisição irá procurar as transições MRM ao longo de todo o comprimento do cromatógrafo para uma única espécie de carne. configurações espectrômetro de massa para uma aquisição MRM variam de acordo com tipo de instrumento e peptídeo. Ver os arquivos de dados gerados usando software de visualização de dados. Clique em XIC (íons extraídos) e na lista suspensa destacar todos os fragmentos (valores Q3) para um único precursor (Q1). Um novo painel será aberta, que mostra apenas as transições selecionadas. Gravar o tempo de retenção (Rt) para grupos de transições simultâneas uma vez que estes correspondem a um único peptídeo. Repita as duas etapas anteriores para cada conjunto de transições de modo a atribuir os picos para os seus respectivos péptidos de cadadas espécies de carne. Registam-se os péptidos marcadores que sejam adequados para fornecer a identificação da espécie (por exemplo, HPGDFGADAQGAMTK péptido, um precursor de m / z = 752, Rt = 12,0 min, para o cavalo), em conjunto com os seus tempos de retenção, e, note que formam pares adequados para a quantificação relativa correspondente . Nota: Por exemplo, o péptido marcador de cavalo (precursor de m / z = 752) tem uma carne correspondente péptido, HPSDFGADAQAAMSK (precursor de m / z = 767, Rt = 13,2 min). A fim de criar um único método dinâmico que abraça todas as espécies de carne, no software de visualização de dados, para cada uma das espécies de carne, por sua vez, abrir os dados de transição XIC para cada precursor (atribuído a um péptido particular, 1.5.8). Zoom sobre o cluster de pico no tempo de retenção selecionado clicando com o botão esquerdo e arrastando o cursor por baixo do cluster. Identificar as transições mais intensos (clicando com o botão direito do mouse sobre o rótulo de pico). registar manualmente as transiçõese tempos de retenção em uma planilha. Para inserir os parâmetros como um novo método dinâmico no software / MS LC, clique em 'Mass Spectrometer "e, em seguida, clique em" Editar Parâmetros "para introduzir as condições de gás de origem. Selecione a opção "Tipo de digitalização" como "MRM (MRM) 'eo' polaridade 'como' Positivo '. Ir para 'Resumo Período' e introduza o tempo de duração (definido como o tempo total para a análise LC e equilibração). Na tabela, clique direito e selecione "declustering potencial (DP)" e "Collision Energia (CP) 'para adicionar essas colunas para a tabela. Nota: A coluna 'Time' agora refere-se ao tempo de retenção esperado (min) para cada transição. Na seção do / MS software de coleta de dados de LC 'Editar Parâmetros ", marque a caixa' Programado MRM '. Introduza o Q1, Q3, Tempo (min), ID, valores DP e CE para as transições criadas na planilha (1.5.21) e salve o método de aquisição (file extensão .dam). Nota: Este método reduz tipicamente o número de transições MRM para o 4 mais intensos para cada péptido e é executada apenas ao longo da janela de tempo a retenção de cada pico de péptido, dando uma sensibilidade melhorada e qualidade dos dados. Um método "dinâmico" é um método de "retenção guiada tempo de janelas ', às vezes chamado de agendamento. 2. Elaboração e análise de amostras de calibração Extracção de misturas à base de carne Usando a carne previamente congelados, em seguida, moído em um pó, preparar uma série de misturas à base de carne por pesagem respectivos valores de carne (massa total de cerca de 300 mg) em 15 ml de tubos de centrífuga de plástico. Adicionar 4 ml de tampão de extracção (cloreto de potássio 0,15 M + M de tampão de fosfato de 0,15 a pH 6,5). Vortex durante 30 seg. Extrair num agitador de laboratório à temperatura ambiente durante 2 h a 250 ciclos / min. Nota: ciclos / min refere-se a um movimento oscilatório. Transferir 2 ml daextracto para um tubo de microcentrifugação de 2 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 4 ° C a 17000 x g. Transferir alíquotas de 200 ul do sobrenadante (reservando uma pequena quantidade para o ensaio de proteína, ver 2.2) em 2 ml de tubos de centrífuga e secam-se utilizando um evaporador centrífugo (programa pré-estabelecido: 50 ° C, sem ventilação e 120 minutos de duração). ensaio de Proteínas Transferência 7 mL alíquotas do sobrenadante reservado (ver 2.1.4) em triplicado nos poços de uma placa de 96 poços. Transferência 7 mL alíquotas de uma série de padrões de proteína, em triplicado, gama 0-1,0 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA), com a mesma placa de 96 poços. Adicionar 200 ul de Coomassie, mais reagente de ensaio de proteína a cada poço. Comparar visualmente a cor dos poços de amostra com os padrões de proteína para verificar as amostras são na gama de padrões de calibração. Se necessário, repita com a amostra diluída por isso torna-se no intervalo. Deixar a placa ste durante 3 min. Estourar as bolhas que se formaram com uma agulha hipodérmica. Analisar a placa no leitor de placas utilizando um protocolo padrão de ponto de extremidade a um comprimento de onda de 595 nm. Determinar a concentração de proteína das amostras utilizando dados de calibração a partir dos padrões de proteína. Nota: Isto é necessário para o cálculo da quantidade de tripsina usada na digestão tríptica. A proteólise de misturas à base de carne Redissolve-se o resíduo seco a partir do passo 2.1.4 em 1 ml de solução de bicarbonato de amónio 25 mM. Misturar bem em um rotamixer. Siga o protocolo do passo 1.1.3 a 1.3.7. Análise por LC / MS Configure o LC / MS como anteriormente (passo 1.5.1). Criar um novo lote de aquisição tal como descrito anteriormente (passos 1.5.9 – 1.5.14), seleccionando o método de aquisição criado no passo de 1.5.24, que utiliza um método / LC MS dinâmica da combinação de todas as espécies de carne, e adquirir os dados para os Digesamostras de carne de ted. Mostrar a cromatograma completo no software de visualização de dados. Mostrar a XIC para cada transição definido por sua vez. Confirmar visualmente cada conjunto contém o número exigido de picos em forma de sino no tempo de retenção esperado, confirmando, assim, a existência do péptido seleccionado. Realizar a quantificação utilizando os dados de visualização software para integrar as áreas dos picos para cada uma das transições de interesse com um duplo clique em "Criar Método quantificação 'na barra de navegação. No painel 'Select Sample' selecione a opção 'arquivo de dados' e 'Exemplo' a ser analisado para gerar uma tabela 'analitos'. Clique no separador 'Integração' para exibir a primeira das transições (analitos) para ser integrado. Clique na caixa "Analito 'para exibir a lista suspensa de transições para baixo. Selecione cada transição por sua vez, para exibi-la e confirmar visualmente o pico correto está selecionado para a integração. para modify ou forçar a integração, clique esquerdo e arraste o cursor sobre o pico alvo (isso será destacado em verde). Clique no botão "Select Peak" e clique em "Aplicar". Salvar o espaço de trabalho como um arquivo método (.qmf). Nota: Isso cria um arquivo Método quantificação para posterior cálculo das áreas dos picos da amostra. 'Assistente de quantificação "Dê um duplo clique na barra de navegação. Na janela "Seleccione Samples 'criar' quantificação Set ', selecionando um único" arquivo de dados', em seguida, um ou mais 'Amostras disponíveis ". Selecione 'Next' para exibir 'Selecione Configurações e consulta' box. Deixar com defaults, selecione "Avançar" para exibir 'Select Method'. A partir da caixa suspensa 'método' selecione o arquivo do "método de integração", criada no passo 2.4.8, em seguida, selecione "Concluir". Nota: Isso cria um 'Resultados da Mesa', incluindo áreas de pico de transição decorrentes das misturas de carne. <li> Salve o «Resultados Table '(arquivo de extensão .rdb), a exportação como um arquivo de texto (.txt) e abri-lo na folha de cálculo para avaliar os dados. gráficos enredo do percentual (por área de pico de transição) de uma carne em outro versus a porcentagem medida (w / w) das duas carnes para o MRM selecionado para transições selecionadas de peptídeos correspondentes, centrando-se nos casos em que os dois fragmentos contêm o mesmo número de aminoácidos, como contado a partir da extremidade C-terminal. Nota: fragmentos idênticos com sites de fragmentação idênticos dar os melhores resultados. Examine as parcelas de 2.4.11 acima. Quer visualmente ou utilizando uma ferramenta de linha de tendência no pacote de trama, identificar um grupo de tramas que são lineares e de gradiente semelhante. Use qualquer uma ou mais destas combinações CPCP mais fragmentos de calibração em amostras de carne real. Nota: Um gráfico que mostra uma inclinação anormal pode indicar qualquer um dos péptidos ou supressão fragmento com uma consequente redução no stre sinalngth. parcelas não lineares podem indicar má detecção de pico ou outros problemas. 3. As amostras de carne Extracção de proteínas a partir de amostras de carne alvo Onde, consumo estranha material não-carne aplicável a partir da amostra, utilizando uma espátula. Por exemplo, raspar o molho e massa de uma lasanha refrigerada. Pesar 20 g de carne num balão de metal. Adiciona-se 100 ml de cloreto de potássio 0,15 M / tampão de monofosfato de potássio 0,15 M a pH 6,5. Extrair as proteínas através da mistura de carne num homogeneizador de alta velocidade durante 1 minuto. Siga o protocolo do passo 2.1.4 – 2.3.2. Análise de amostras por LC / MS Repita o passo 2.4.2 para adquirir dados usando o método LC / MS dinâmico. Identificar os peptídeos de cada mioglobina carne como foi executado no passo 2.4.3. Para quantificação, utilizar software de quantificação para integrar as áreas dos picos para cada transição de interesse,conforme descrito no passo 2.4.9. Para a identificação de espécies em uma mistura, gravar os péptidos marcadores que cumpra os critérios acordados para os números de transições e sinalizar ao ruído para as transições. Para quantificação, use áreas de pico de transição integradas, tal como acordado a partir do passo 2.4.12 e, usando percentagem em área de pico de transição, calcular a percentagem de mioglobina das duas espécies na mistura. Use o conhecimento prévio da literatura 18 dos níveis de mioglobina prováveis ​​nas carnes para estimar os montantes w / w relativos de duas carnes presentes na amostra.

Representative Results

Em um único experimento MRM-modo dinâmico cada transição programada é tratada separadamente (como contagens por segundo detector, cps) mais de uma janela de tempo de retenção especificado. Portanto, a partir de todos os dados coletados em um experimento, o pico de intensidade para cada transição pode ser extraído individualmente. Em seguida, o único sinal finito é para a janela de tempo de retenção definido para essa transição. Do lado de fora da janela, o sinal é zero por definição. O sinal para qualquer um transição, por exemplo, 752 → 1269 de cavalo (péptido monoisotópico massa 1,501.66 daltons, um precursor de ião m / z 751.84 daltons, cobrar Estado = 2, fragmento ião Y 13) tem tipicamente a competir apenas com ruído de medição e não de outros picos de transição que podem, talvez, ser a partir de outras espécies. A saída é, portanto, um conjunto de picos limpas, uma por transição, a um tempo de retenção comum para essas transições que compartilham de um íon precursor comum. <p class = "jove_content" fo: manter-together.within-page = "1"> A Figura 1 mostra a saída para o conjunto de quatro transições → 752 (1269, 706, 248, 1366) para uma mistura de 1% w / w cavalo em carne bovina. Uma vez que os quatro transições exibidos estão associados com o cavalo, e estão ausentes em amostras de carne pura, cordeiro ou de porco, estes picos significar a presença de cavalo. Dependendo dos critérios de robustez, um conjunto de dois ou mais transições cada superior a algum sinal especificado ao nível de ruído estabelece identificação. Por conseguinte, esta figura estabelece a presença de cavalo na mistura de 1% w / w em carne de cavalo. Ocasionalmente, uma única transição isolado é detectado. Isto indica uma correspondência possibilidade de ião precursor e um único fragmento, possivelmente a partir de uma proteína estranha, com os esperados a partir do sistema e programado no espectrómetro de massa. A singularidade do pico, e a sua ocorrência em um tempo de retenção inesperada, é o Signature de uma transição acidental que pode ser ignorado. A área sob cada pico de transição pode ser calculado individualmente. Com base em um fragmento adequado, a proporção de cavalo para áreas de pico de transição da carne, por exemplo, 752 → 1269 (cavalo) a 767 → 1299 (carne), irá ser proporcional à razão de carnes reais na mistura. A Figura 2 mostra um lote de percentagem em área de pico para estas duas transições em relação ao peso percentual para peso do cavalo em uma mistura de cavalo com carne bovina. Se as áreas de pico percentual de transição coincidir com o peso percentual de peso de carne, em seguida, a inclinação é 1. A inclinação neste enredo é de 1,03, indicando que, para estas transições e par CPCP, as áreas de pico de transição dar uma medida confiável das quantidades relativas das duas carnes na mistura. Se a carne de cavalo na amostra foi duas vezes mais rico em mioglobina como a carne, em seguida, com outros factores inalterada, a inclinação da A linha seria maior do que um. Figura 1. intensidades de transição MRM em função do tempo de retenção de 1% w / w cavalo em carne bovina. As transições são 752 → (1269, 706, 248, 1366), mostrado em laranja, preto, azul e verde, respectivamente. O péptido marcador é HPGDFGADAQGAMTK. Os quatro fragmentos de transição pode ser denotado Y 13, Y 7, Y 2 e Y 14, respectivamente, onde Y N indica a contagem em aminoácidos a partir da extremidade n péptido C-terminal. O sinal de ruído varia entre 23 e 53 ao longo dos quatro transições. Uma linha vermelha adicional denota a transição 752 → 1269 para o cavalo 0%, 100% de carne para comparação. Apenas a região não-zero do tempo de retenção é exibido. Esta figura foi modificado a partir de Watson et al. 3.es / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2. Lote de cavalo em carne, como o peso por cento do peso, contra cavalo em carne como área do pico por cento de transição. O enredo usa o par de peptídeos de carne (767) e cavalo (752) e o ião fragmento y 13 para ambos. Se A indica a área do pico, em seguida, a ordenada é H 100 A / (A + A H B). A inclinação da linha de melhor ajuste (R 2 = 0,99) é 1,03. Este valor foi modificado a partir de Watson et al. 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A selecção de uma proteína alvo adequado é importante. Uma boa proteína alvo precisa ter formas correspondentes em espécies de interesse, suficiente variação de sequência dependente da espécie, especificidade das espécies, e existem em quantidades acessíveis dentro dos organismos. Para avaliar a misturas que tenham sido submetidas a tratamento (por exemplo, tratamento de calor), uma proteína que tem uma sequência relativamente imune a que o processamento é desejável. A mioglobina é um bom candidato para carnes vermelhas, incluindo carnes vermelhas cozidas, mas não é a única possibilidade. Uma vez que a proteína alvo é decidido, a parte mais crítica do protocolo é a proteólise da proteína. Uma proteína diferente da mioglobina pode também exigir um protocolo de proteólise alternativa.

O protocolo como descrito inclui um segmento com base em proteína de referência purificado. O objectivo é descobrir janelas de tempo de retenção e íons precursores e fragmento adequados. Este segmento é muito útil, mas não essencial.

<pclass = "jove_content"> Apesar de pares de peptídeos correspondentes de duas espécies de interesse podem ser listados, mesmo sem experiência, às vezes é o caso que uma diferença sequência tem consequências dramáticas para o perfil de digestão. Por exemplo, o par de péptido VLGFHG (carne) e ELGFQG (cavalo) dá um resultado anómalo quantificação (manifestam-se como uma inclinação inferior a um na Figura 2). Isto é porque este péptido resulta de uma clivagem KE relativamente suprimida, fazendo uma sub-estimativa do nível de cavalo na mistura. péptidos de partida correspondente com aminoácidos diferentes são, por conseguinte, melhor evitado. Muitas vezes, os fragmentos a partir de dois péptidos correspondentes têm sequências de aminoácidos idênticas e são bem comportado, mas este não é sempre o caso, e necessita de ser verificada durante o desenvolvimento do método. A identificação das espécies é muito menos sensível a estas questões do que quantificação relativa.

O protocolo foi demonstrada durante quatro carne vermelhas ^3. espécies de carne adicionais podem ser incluídos, embora a qualidade da forma do pico de transição pode deteriorar-se muitos péptidos marcadores co-eluir, reduzindo eficazmente o tempo de permanência e, finalmente, degradando estimativas quantificação relativa. A instrumentação, já disponível, vai melhorar isso. Um problema relacionado é que nem todas as carnes têm diferentes myoglobins. Por exemplo, cavalo, burro e myoglobins zebra são idênticos e, portanto, estritamente falando, o método só é capaz de detectar a cavalo ou de burro ou zebra na carne de bovino. Em alguns casos, mesmo que mioglobinas não são idênticos, alguns péptidos-chave pode ser. Por exemplo, alguns péptidos marcadores derivados de mioglobina de cordeiro também aparecem na cabra.

Uma complicação de frente para este e qualquer outro método de quantificação baseado em proteínas é que o nível de proteína deve ser assumida constante para todas as espécies, se os níveis de proteínas ou péptidos são trivialmente a igualar a níveis de carnes em uma mistura. Para a mioglobina e quatro m vermelhocome isso não é uma verdade universal. Os níveis em geral, são espécies dependentes, com carne de porco que exibem o nível mais baixo dos quatro. Além disso, o nível de mioglobina varia com carne cortada e idade dos animais. Assim, embora proporções de áreas de pico de transição mapear de forma confiável para os rácios de mioglobina, o mapeamento a proporção de carnes reais é um desenho estimativa sobre os pressupostos relativos aos prováveis ​​fontes de carnes na mistura.

A abordagem descrita neste trabalho difere em um número de maneiras de outras contribuições publicadas. Uma via mais típico é a utilização de métodos de proteómica para identificar vários péptidos marcadores dependente de espécies diferentes, caso em que os marcadores de espécies diferentes possuem nenhuma relação particular com um outro ^8-12,14,19. Por outro lado, nós selecionamos proteínas comuns a todas as espécies de interesse até espécies dependentes de sequência de variantes ^3. Para além de ser essencial para a nossa estratégia quantificação relativa, isto tem a vantagem que a amostraestratégias de preparação pode ser optimizada. Além disso, essas proteínas correspondentes pode ser esperado comportar-se de forma semelhante, por exemplo, na extracção ou no processamento comercial de amostras, tais como cozinhar ou conservas. A identificação das espécies, então, normalmente procede através da detecção de peptídeos marcadores diferentes, enquanto que nos abordagem CPCP identificação de espécies procede via detecção de peptídeos estreitamente relacionados que possuem normalmente um ou dois diferenças de sequência. Finalmente, a quantificação de proteínas para calcular a percentagem em peso de uma espécie na outra pode prosseguir através convencionalmente quantificação absoluta de cada proteína baseada separadamente em padrões conhecidos ^7,14,15. No entanto, utilizando o método de CPCP não há necessidade de métodos de calibração. Em vez disso, os níveis relativos são estimados através da comparação de intensidades de sinal de dois péptidos correspondentes a partir das duas espécies, contornando a fase de medição absoluta no seu conjunto. Uma vez que o objetivo final é uma percentagem em peso de uma espécie em another, uma quantificação relativa, então o CPCP é tanto mais direta e mais simples do que comparar duas medidas quantificação absoluta. Estas características traduzem em tempos experimentais curtos, previstos para ser cerca de duas horas usando protocolos refinados, tornando a técnica útil como uma ferramenta de vigilância rápida no campo da detecção de fraudes alimentos.

Materials

Uniprot database	www.uniprot.org		Freely accessible database of protein sequences
Skyline software	www.skyline.gs.washington.edu		Free software to download that enables the creation of targeted methods for proteomic studies, peptide and fragment prediction
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	O9830
Methanol, HPLC grade	Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk	10674922
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk	10010010
Urea	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	U5378
Trypsin(from bovine pancreas treated with TPCK)	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	T1426
Formic acid	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	F0507
Coomassie Plus Protein Assay Reagent	Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com	1856210
Protein standard	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, UK www.sigmaaldrich.com	P0914
Ultra Turrax homogeniser T25	Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk	13190693
Edmund and Buhler KS10 lab shaker
Heraeus Fresco 17 Centrifuge	Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com	75002420
Vacuum centrifuge RC 1022	Jouan
Plate Reader
Strata-X 33u polymeric reversed-phase cartridges 60 mg/3 ml tubes	Phenomenex, Macclesfield, UK	8B-S100-UBJ
4000 QTrap triple-quadrupole mass spectrometer	AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com
1200 rapid resolution LC system	Agilent, Stockport, UK
XB C18 reversed-phase capillary column (100 x 2.1mm, 2.6µ particle size)	Phenomenex, Macclesfield, UK www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 software	AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com		QTrap data acquisition and analysis, including peak area integration
Autosampler vials