En Mimic af tumor mikromiljø: En simpel metode til at generere berigede Cell Befolkninger og Undersøgelse intercellulær kommunikation
Summary
We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.
Abstract
Forståelse af de tidlige heterotypiske interaktioner mellem kræftceller og det omgivende ikke-kræft stroma er vigtigt at belyse de begivenheder, der fører til stromale aktivering og etablering af tumor mikromiljø (TME). Adskillige in vitro- og in vivo modeller af TME er blevet udviklet; dog generelt disse modeller ikke let tillader isolering af individuelle cellepopulationer, under ikke-forstyrrende betingelser, til yderligere undersøgelse. For at omgå denne vanskelighed har vi ansat en in vitro TME model ved hjælp af en celle vækstsubstrat bestående af en permeabel mikroporøs membran insert, der tillader simpel generation af højt berigede cellepopulationer vokset intimt, men hver for sig på hver side af indsatsens membran for udvidet samarbejde -Kultur gange. Gennem brug af denne model, er vi i stand til at frembringe stærkt beriget cancerassocieret fibroblast (CAF) populationer fra normale diploide humane fibroblaster efterco-kultur (120 timer) med meget metastatiske humane brystcarcinomaceller, uden anvendelse af fluorescerende tagging og / eller cellesortering. Derudover ved at modulere porestørrelse af indsatsen, kan vi kontrollere for den tilstand af intercellulær kommunikation (f.eks gap junction-kommunikation, secernerede faktorer) mellem de to heterotypiske cellepopulationer, der tillader undersøgelse af mekanismerne bag udviklingen af TME, herunder betydningen af gap-junction permeabilitet. Denne model tjener som et værdifuldt redskab i at øge vores forståelse af de indledende begivenheder, der fører til kræft-stroma indvielse, den tidlige udvikling af TME, og den modulerende effekt af stroma på svarene fra kræftceller til terapeutiske midler.
Introduction
Tumoren mikromiljø (TME) er et meget komplekst system bestående af carcinomaceller, der sameksisterer og udvikle sig sammen med vært stroma. Denne stromale komponent består typisk af fibroblaster, myofibroblaster, endotelceller forskellige immun komponenter, samt en ekstracellulær matrix 1. En væsentlig bestanddel, ofte størstedelen af denne stroma, aktiveres fibroblaster, ofte omtalt som cancerassocierede fibroblaster eller carcinoma-associerede fibroblaster (CAF) 2,3. Modsætning til normale, ikke-aktiverede fibroblaster, CAF bidrager til tumorinitiering, progression, angiogenese, invasion, metastase, og fornyet 4-11 i en lang række carcinomer, herunder bryst-, prostata-, lunge-, pancreas, hud, colon, spiserør, og ovarie 5,6,12-17. Alligevel forbliver den nøjagtige karakter af bidraget fra CAF hele kræft patogenese dårligt defineret. Endvidere har klinisk evidens påvist en prognostisk værdi af CAF, Korrelere deres tilstedeværelse til high-grade maligniteter, svigt terapi og samlet dårlig prognose 10,18,19.
Det er klart, at øge vores forståelse af de initierende hændelser i CAF udvikling, samt de intercellulære kommunikation medierende deres rolle i TME, kan give spændende nye terapeutiske mål og forbedrede strategier, der kunne forbedre patienternes resultater. Mod dette mål, har flere in vivo og in vitro-modeller blevet udviklet. Mens in vivo tilgange er mere reflekterende af patienternes TME, de besidder begrænsninger, herunder den enorme kompleksitet og heterogenitet både inden for og mellem tumorer. Desuden tumor prøver fra mennesker ofte repræsenterer højt udviklet TME og tillader ikke en forståelse af de TME initierende hændelser. Eksperimentelle dyrestudier tilbyde nogle fordele, men generalisering af data fra dyreforsøg til mennesker skal gøres med forsigtighed på grund af forskelle i physiologi mellem mennesker og dyr, såsom gnavere (fx til thiolkemi 20, stofskifte 21, tolerance understrege 22, etc.). Yderligere, i modsætning til menneskelige befolkning, som er genetisk heterogent og laboratoriedyr er typisk avlet til homogenitet. Det er også ofte vanskeligt at undersøge transiente fysiologiske variationer og cellefænotype ændringer, såvel som til at styre specifikke eksperimentelle parametre ved hjælp dyr såsom gnavere. Således in vitro 2- og 3-dimensionelle (2D og 3D) vævskulturplader modeller er ofte anvendt til at fremme den grundlæggende forståelse af TME udvikling. På trods af deres mangel på en præcis skildring af kompleksiteten af in vivo systemer, disse modeller giver fordele, som i høj grad letter mekanistiske undersøgelser. In vitro-modeller giver mulighed for en mere forenklet, fokuseret, og omkostningseffektiv analyse af TME, hvorved statistisk signifikant data kan genereres iceller fri af systemiske variationer, der opstår i dyr.
Der er flere varianter af in vitro systemer. De to mest almindeligt anvendte TME in vitro-modeller består af blandet monolag eller sfæroide cellekulturer. Begge dyrkningsmetoder er fordelagtige for de grundlæggende undersøgelser af intercellulære interaktioner (f.eks normale celler med tumorceller) og til analyse af forskellige TME specifikke cellefænotype ændringer (f.eks, fremkomsten af cancerassocierede fibroblaster fra normale fibroblaster). Derudover sfæroiderne kan skabe en mere reflekterende vævslignende struktur af TME, og kan være repræsentativ for tumor heterogenitet 23. Men sphæroider producerer ofte meget varierende ilt spænding gradienter tværs lag, som kan komplicere eksperimentelle konklusioner 24. Desværre er begge modeller yderst begrænset i deres evne til at isolere rene cellepopulationer til yderligere karakterisering og undersøgelse efter samarbejdekultur. At gøre dette ville kræve mindst én celletype at være fluorescens-mærket eller mærket med en identificering maker, og derefter udsætte den blandede co-kultur til omfattende forarbejdning og cellesortering at adskille cellepopulationer. Mens en cellesorterer er i stand til at isolere en temmelig ren cellepopulation, må man være bekendt med cellulært stress og potentiel mikrobiel kontaminering risici 25.
For at lette forståelsen af intercellulære kommunikation, er blevet viet en stor indsats i retning af at udvikle og optimere in vitro-systemer, der nøje efterligner in vivo miljø, mens tillader en forenklet tilgang. Et sådant værktøj er den permeable mikroporøse insert, en membran substrat, som først blev udviklet i 1953 26 og derefter tilpasset til forskellige formål og undersøgelser (f.eks cellepolaritet 27, endocytose 28, lægemiddeltransport 29, tissue modellering 30, fertilization 31, tilskuer-virkning 32,33, etc.). Dette system tillader vækst af celler med in vivo-lignende anatomisk og funktionel differentiering, såvel som ekspression af mange in vivo markører 34,35, som ikke observeres ved dyrkning på uigennemtrængeligt plasticware. Endvidere den ekstremt tynde porøse membran (10 um tyk) tillader hurtig diffusion af molekyler og ækvilibreringstider, som simulerer in vivo miljø og tillader uafhængig cellulær funktion på både apikale og basolaterale celle domæner. En yderligere fordel ved indsatsens nytte som et TME-system er dets fysiske adskillelse af to heterotypiske cellepopulationer dyrket på hver side af membranen i de samme miljømæssige betingelser, samtidig med at forskellige former for intercellulær kommunikation gennem membranen porer. Selvom fysisk adskilt, er de to cellepopulationer metabolisk koblet via udskilte elementer og, som debeskrevet her, også gennem gap-forbindelsesepitop kanaler. Derudover, ved at opretholde inserterne på in vivo delvis oxygenspænding (PO 2), modellen reducerer komplikationer af oxygen- og kemiske gradienter observeret i andre systemer. Snarere, det øger forståelsen af naturlige mekanismer, der styrer TME. Især kan de to cellepopulationer let isoleres med høj renhed, uden fluorescerende tagging og / eller cellesortering efter længere perioder co-kultur.
Her beskriver vi et in vitro TME-protokol bestående af humane brystcarcinomaceller og humane fibroblaster dyrket henholdsvis på hver side af en permeabel mikroporøs membran insert, men alligevel i kontinuerlig tovejskommunikation gennem membranporerne. Vi viser, at ved hjælp af membraner med forskellige porestørrelser, bidraget af en bestemt type af intercellulære kommunikation (f.eks udskilles faktorer versus gap junctions) til udviklingaf TME kan undersøges.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her er en enkel, smidig in vitro procedure (figur 1), der udnytter en permeabel mikroporøs membran insert for at skabe højt beriget individuelle cellepopulationer fra en co-kultur af heterotypiske celler. Betydeligt, modellen er velegnet til at undersøge forskellige former for intercellulære kommunikation. De kritiske trin omfatter vælge den passende porestørrelse indsats til specifik eksperimentel interesse (s), podning første cellepopulation på undersiden af ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), the National Institutes of Health (CA049062), and the National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).
Materials
| For Cell Culture | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
| 0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 mL Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Immunofluorescent Microscopy | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence – 1:5000 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence – 1:2000 |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
| 16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1X PBS |
| Premium Cover Glass (22×22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Flow Cytometric Analysis | |||
| Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot – 1:10000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clinical Gastroenterology and Hepatology: the Official Clinical Practice. Journal of the American Gastroenterological Association. 7 (11 Suppl), S44-S47 (2009).
- Dabbous, M. K., Haney, L., Carter, L. M., Paul, A. K., Reger, J. Heterogeneity of fibroblast response in host-tumor cell-cell interactions in metastatic tumors. Journal of Cellular Biochemistry. 35 (4), 333-344 (1987).
- Olumi, A. F., Grossfeld, G. D., Hayward, S. W., Carroll, P. R., Tlsty, T. D., Cunha, G. R. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Recherche en cancérologie. 59 (19), 5002-5011 (1999).
- Orimo, A., Gupta, P. B., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
- Schürch, W., Seemayer, T. A., Lagacé, R., Gabbiani, G. The intermediate filament cytoskeleton of myofibroblasts: an immunofluorescence and ultrastructural study. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 403 (4), 323-336 (1984).
- Nakagawa, H., Liyanarachchi, S., et al. Role of cancer-associated stromal fibroblasts in metastatic colon cancer to the liver and their expression profiles. Oncogene. 23 (44), 7366-7377 (2004).
- Choi, Y. P., Lee, J. H., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Ito, M., Ishii, G., Nagai, K., Maeda, R., Nakano, Y., Ochiai, A. Prognostic impact of cancer-associated stromal cells in patients with stage I lung adenocarcinoma. Chest. 142 (1), 151-158 (2012).
- Gaggioli, C., Hooper, S., et al. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature Cell Biology. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Navab, R., Strumpf, D., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7160-7165 (2011).
- Hwang, R. F., Moore, T., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Recherche en cancérologie. 68 (3), 918-926 (2008).
- Sneddon, J. B., Zhen, H. H., et al. Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14842-14847 (2006).
- De Wever, O., Nguyen, Q. -. D., et al. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (9), 1016-1018 (2004).
- Zhang, C., Fu, L., et al. Fibroblast growth factor receptor 2-positive fibroblasts provide a suitable microenvironment for tumor development and progression in esophageal carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (12), 4017-4027 (2009).
- Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M. CLIC4 mediates TGF-β1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. , (2009).
- Crawford, Y., Kasman, I., et al. PDGF-C mediates the angiogenic and tumorigenic properties of fibroblasts associated with tumors refractory to anti-VEGF treatment. Cancer Cell. 15 (1), 21-34 (2009).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Seminars in Cancer Biology. 25, 61-68 (2014).
- Messina, J. P., Lawrence, D. A. Effects of 2-mercaptoethanol and buthionine sulfoximine on cystine metabolism by and proliferation of mitogen-stimulated human and mouse lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 14 (7), 1221-1234 (1992).
- Ames, B. N. Endogenous oxidative DNA damage, aging, and cancer. Free Radical Research Communications. 7 (3-6), 121-128 (1989).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Upreti, M., Jamshidi-Parsian, A., et al. Tumor-endothelial cell three-dimensional spheroids: new aspects to enhance radiation and drug therapeutics. Translational Oncology. 4 (6), 365-376 (2011).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Muraki, Y., Hongo, S., Ohara, Y. Contamination of the cell sorter fluidics system with the water-borne bacterium Burkholderia cepacia. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (2), 105-107 (2012).
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Tan, S., Tompkins, L. S., Amieva, M. R. Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche. PLoS Pathogens. 5 (5), e1000407 (2009).
- Hyman, T., Shmuel, M., Altschuler, Y. Actin is required for endocytosis at the apical surface of Madin-Darby canine kidney cells where ARF6 and clathrin regulate the actin cytoskeleton. Molecular Biology of the Cell. 17 (1), 427-437 (2006).
- Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (80), e50638 (2013).
- Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (104), e53084 (2015).
- Bath, M. L. Inhibition of in vitro fertilizing capacity of cryopreserved mouse sperm by factors released by damaged sperm, and stimulation by glutathione. PLoS ONE. 5 (2), e9387 (2010).
- Zhao, Y., De Toledo, S. M., Hu, G., Hei, T. K., Azzam, E. I. Connexins and cyclooxygenase-2 crosstalk in the expression of radiation-induced bystander effects. British Journal of Cancer. 111 (1), 125-131 (2014).
- Buonanno, M., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. Increased frequency of spontaneous neoplastic transformation in progeny of bystander cells from cultures exposed to densely ionizing radiation. PLoS ONE. 6 (6), e21540 (2011).
- Byers, S. W., Hadley, M. A., Djakiew, D., Dym, M. Growth and characterization of polarized monolayers of epididymal epithelial cells and Sertoli cells in dual environment culture chambers. Journal of Andrology. 7 (1), 59-68 (1986).
- Pitt, A., Gabriels, J. Epithelial cell culture on microporous membranes. American Biotechnology Laboratory. 4 (5), 38-45 (1986).
- Buonanno, M., de Toledo, S. M., Pain, D., Azzam, E. I. Long-term consequences of radiation-induced bystander effects depend on radiation quality and dose and correlate with oxidative stress. Radiation Research. 175 (4), 405-415 (2011).
- Ducrest, A. -. L., Amacker, M., Lingner, J., Nabholz, M. Detection of promoter activity by flow cytometric analysis of GFP reporter expression. Nucleic Acids Research. 30 (14), e65 (2002).
- Mercier, I., Casimiro, M. C., Wang, C. Human breast cancer-associated fibroblasts (CAFs) show caveolin-1 down-regulation and RB tumor suppressor functional inactivation: implications for the response to hormonal therapy. Cancer Biology & Therapy. , (2008).
- Martinez-Outschoorn, U. E., Pavlides, S., et al. Tumor cells induce the cancer associated fibroblast phenotype via caveolin-1 degradation: implications for breast cancer and DCIS therapy with autophagy inhibitors. Cell Cycle. 9 (12), 2423-2433 (2010).
- Witkiewicz, A. K., Dasgupta, A., et al. Loss of stromal caveolin-1 expression predicts poor clinical outcome in triple negative and basal-like breast cancers. Cancer Biology & Therapy. 10 (2), 135-143 (2014).
- Zhao, X., He, Y., et al. Caveolin-1 expression level in cancer associated fibroblasts predicts outcome in gastric cancer. PLoS ONE. 8 (3), e59102 (2013).
- Shaul, P. W., Anderson, R. G. Role of plasmalemmal caveolae in signal transduction. The American Journal of Physiology. 275 (5 Pt 1), L843-L851 (1998).
- Fujimoto, T., Kogo, H., Nomura, R., Une, T. Isoforms of caveolin-1 and caveolar structure. Journal of Cell Science. 113 (Pt 19), 3509-3517 (2000).
- Wartiovaara, J., Lehtonen, E., Nordling, S., Saxen, L. Do Membrane Filters prevent Cell Contacts. Nature. 238 (5364), 407-408 (1972).
- Tyan, S. -. W., Kuo, W. -. H., et al. Breast cancer cells induce cancer-associated fibroblasts to secrete hepatocyte growth factor to enhance breast tumorigenesis. PLoS ONE. 6 (1), e15313 (2011).
- Xu, J., Lu, Y., Qiu, S., Chen, Z. -. N., Fan, Z. A novel role of EMMPRIN/CD147 in transformation of quiescent fibroblasts to cancer-associated fibroblasts by breast cancer cells. Cancer Letters. 335 (2), 380-386 (2013).
- Hoffman, R. M. Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche. Breast Cancer Research : BCR. 15 (3), 310 (2013).
- Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
- Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50 (4), 243-248 (1985).
- Vaupel, P., Schlenger, K., Knoop, C., Höckel, M. Oxygenation of human tumors: evaluation of tissue oxygen distribution in breast cancers by computerized O2 tension measurements. Recherche en cancérologie. 51 (12), 3316-3322 (1991).
