Мимической опухолевого микроокружения: Простой метод для генерации обогащается мобильных групп населения и исследование межклеточной коммуникации

Summary

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Abstract

Понимание ранних гетеротипические взаимодействий между раковыми клетками и окружающим нераковая стромы играет важную роль в выяснении событий, приведших к активации стромы и создания микросреды опухоли (TME). Несколько в пробирке и в естественных условиях модели в TME были разработаны; Тем не менее, в целом, эти модели не позволяют легко изоляции отдельных популяций клеток, при невозмущающие условиях, для дальнейшего изучения. Чтобы обойти эту трудность, мы использовали модель TME ин витро с использованием субстрата роста клеток , состоящую из проницаемого микропористой мембраны вкладышем , который обеспечивает простое формирование популяций высоко обогащенных клеток , выращенного тесно, все же по отдельности, по обе стороны мембраны Вкладыше в течение длительного сотрудничества -Культура раз. Благодаря использованию этой модели, мы способны генерировать значительно обогатили рак, связанный фибробласты (CAF) популяции из нормальных диплоидных фибробластов человека следующиесовместное культивирование (120 ч) с высокой метастатической активностью клеток карциномы молочной железы человека, без использования флуоресцентного мечения и / или сортировки клеток. Кроме того, путем модуляции размер пор вставки, мы можем контролировать в режиме межклеточной коммуникации (например, разрыв спая связи, секретируемые факторы) между двумя популяциями гетеротипичной клеток, что позволяет исследовать механизмы , лежащие в основе развития , закрепленных в TME, в том числе роль проницаемости щелевого соединения. Эта модель служит ценным инструментом в деле укрепления нашего понимания исходных событий, приводящих к раку-стромы инициации, ранней эволюции TME и модулирующего влияния стромы на ответах раковых клеток в терапевтических агентов.

Introduction

Микроокружение опухоли (TME) представляет собой весьма сложную систему, состоит из клеток карциномы, которые сосуществуют и развиваются вместе с принимающей стромы. Этот компонент , как правило , состоит стромальных фибробластов, миофибробластов, эндотелиальных клеток, различных иммунных компонентов, а также внеклеточного матрикса ^1. Существенным компонентом, часто большинство этой стромы, активизируются фибробласты, часто упоминается как рак , связанный фибробластов или карциномы ассоциированных с фибробластами (CAF) ^2,3. В отличие от обычных, не активированные фибробласты, CAFS способствуют инициации опухоли, прогрессии, ангиогенез, инвазию, метастазирование и рецидив ^4-11 в самых разнообразных карцином, включая рак молочной железы, простаты, легких, поджелудочной железы, кожи, толстой кишки, пищевода, и яичник ^5,6,12-17. Тем не менее, точный характер вклада CAFS по всему патогенеза рака остается плохо определена. Кроме того, клинические данные продемонстрировали прогностическое значение CAFS, Соотнося свое присутствие в высокосортных злокачественных новообразований, неполадкам терапии, а также в целом неблагоприятным прогнозом ^10,18,19.

Очевидно, что повышение наше понимание инициирующих событий в развитии CAF, а также межклеточных коммуникаций, опосредующих их роль в TME, может обеспечить захватывающие новые терапевтические цели и улучшенные стратегии, которые могли бы улучшить результаты лечения пациентов. На пути к этой цели, несколько в естественных условиях и в пробирке моделей были разработаны. В то время как подходы в естественных условиях в большей степени отражают TME пациентов, они обладают ограничениями, в том числе огромную сложность и неоднородность как внутри , так и между опухолями. Кроме того, образцы опухолей от человека предметов часто представляют собой высокоразвитые TME и не позволяют понимание инициирующих событий TME. Экспериментальные исследования на животных предлагают некоторые преимущества, однако обобщение данных животных к людям следует делать с осторожностью из-за различий в physiгия между людьми и животными , такими как грызуны (например, тиол химии ^20, скорость обмена веществ ^21, толерантностью к стресс ²² и т.д.). Кроме того, в отличие от человеческого населения, что генетически гетерогенным по природе, лабораторных животных, как правило, разводят до однородности. Кроме того, часто бывает трудно исследовать переходные физиологические колебания и изменения клеточного фенотипа, а также для управления для конкретных экспериментальных параметров с использованием животных, таких как грызуны. Таким образом, в пробирке 2- и 3-мерные (2D и 3D) моделей для культуры ткани часто используются для продвижения основного понимания развития TME. Несмотря на отсутствие точного отображения сложности систем в естественных условиях, эти модели предлагают преимущества , которые значительно облегчают механистические исследования. В пробирке модели позволяют более упрощенной, ориентированной и экономически эффективного анализа TME, в результате чего статистически значимое данные могут быть получены вклетки свободных системных изменений, которые возникают у животных.

Есть несколько разновидностей систем в лабораторных условиях . Два наиболее часто используемых TME модели в пробирке состоят из смешанного монослоя или сфероида клеточных культур. Оба метода культуры выгодны для основных исследований межклеточных взаимодействий (например, нормальные клетки с опухолевыми клетками) , а также для анализа различных TME специфических изменений клеточного фенотипа (например, появление раковых ассоциированных фибробластов от нормальных фибробластов). Кроме того, сфероиды способны создать более отражающей ткани-подобную структуру TME, и может быть представителем опухоли неоднородностью ^23. Однако сфероиды часто производят широко различные градиенты напряжения кислорода через слои, которые могут осложнить экспериментальные выводы ^24. К сожалению, обе модели крайне ограничены в своей способности изолировать чистых клеточных популяций для дальнейшей характеризации и изучения следующего со-культура. Для этого потребуется, по меньшей мере, один тип клеток, чтобы быть флуоресцентно-меченый или маркированный с идентификационным мейкера, а затем подвергая смешанное совместное культивирование обширному обработки и сортировки клеток, чтобы отделить клеточные популяции. В то время как клеточный сортер способна изолировать достаточно чистой популяции клеток, нужно быть осведомленным клеточного стресса и потенциального микробного загрязнения риски ^25.

Для облегчения понимания межклеточной коммуникации, большие усилия были посвящены в направлении разработки и оптимизации в пробирке систем , которые тесно имитируют среду в естественных условиях, при этом возможность упрощенного подхода. Одним из таких инструментов является проницаемой микропористой вкладыш, подложка мембрана , которая была впервые разработана в 1953 году ²⁶ , а затем адаптирована для различных областей применения и исследований (например, клеточной полярности ^{27, 28,} эндоцитоза транспорта наркотиков ^29, моделирование ткани ^30, Фертilization ^31, эффект свидетеля ^32,33 и т.д.). Эта система позволяет рост клеток с анатомическими в естественных условиях -как и функциональной дифференциации, а также экспрессии многих в естественных условиях маркеров ^34,35, которые не наблюдаются при культивировании на непроницаемом из пластмассы. Кроме того, чрезвычайно тонкая пористая мембрана (толщиной 10 мкм) позволяет быструю диффузию молекул и времени установления равновесия, моделирующей среды в естественных условиях и допускает независимое функционирование сотовой связи в обоих апикальных и базолатеральных доменов клеток. Дополнительным преимуществом утилиты Вкладыше в качестве системы TME является его физическое разделение двух популяций клеток, выращенных гетеротипические по обе стороны мембраны, в одних и тех же условиях окружающей среды, сохраняя при этом различные режимы межклеточной коммуникации через поры мембраны. Хотя физически разделены, две клеточные популяции метаболически соединены посредством секретируемых элементов и, как дездесь описано, а также через щелевые-узловой каналов. Кроме того, за счет поддержания вставок при растяжении в естественных условиях частичного кислорода (PO _2), модель уменьшает осложнения , кислорода и химических градиентов , наблюдаемых в других системах. Скорее всего, это увеличивает понимание природных механизмов, контролирующих ТМЕ. Следует отметить, что две клеточные популяции могут быть легко изолированы с высокой степенью чистоты, без флуоресцентного мечения и / или сортировки клеток после длительных периодов совместной культуры.

Здесь мы опишем протокол TME в пробирке , состоящей из клеток карциномы молочной железы человека и фибробластов человека , выращенных соответственно, по обе стороны от проницаемой микропористых мембран вставки, но все же в непрерывной двусторонней связи через поры мембраны. Показано , что при использовании мембран с различными размерами пор, вклад конкретного типа межклеточной коммуникации (например, секретируемые факторы в сравнении щелевых контактов) для развитияиз TME можно исследовать.

Protocol

1. Подготовка культуральной среды и клеток Приготовьте 500 мл минимально необходимой среды Игла, дополненной 12,5% (об / об) инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-аланил-L-глутамина, и 100 единиц пенициллина и 100 мкг стрептомицина на мл. Примечание: Среда д?…

Representative Results

Здесь мы адаптировали проницаемой микропористой мембраны вставки для разработки гетеротипичной системы клеток совместного культивирования в пробирке , который имитирует микроокружение опухоли в естественных условиях (рисунок 1). Эта система позв…

Discussion

Протокол , описанный здесь , представляет собой простой, адаптируемой в пробирке процедуры (рисунок 1) , которая использует проницаемой микропористой мембраны вставки для создания высоко обогащенные отдельных клеточных популяций из со-культуры гетеротипичной клеток. Важ…

Materials

For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line	PerkinElmer	119261	Parental line: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line	Cell Biolabs	AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Sigma	F6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine)	Corning Cellgro	25-015-Cl
Penicillin Streptomycin Solution, 100X	Corning Cellgro	30-002-Cl
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore)	Costar	3450
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore)	Greiner bio-one	657610
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore)	Costar	3452
6-well Culture Plate	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 cell culture flask	CellStar	658 170
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X	Corning Cellgro	21-040-CV	without calcium & magnesium
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X	Corning Cellgro	25-053-Cl
15 mL Centrifuge Tube	CellTreat	229411
35 x 10 mm Cell Culture Dish	Greiner bio-one	627 160
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Immunofluorescent Microscopy
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ Immunofluorescence – 1:5000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ Immunofluorescence – 1:2000
Bovine Serum Albumin – Fraction V	Rockland	BSA-50	Immunoglobulin and protease free
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution	ThermoFisher Scientific	28908	Dilute to 4% with 1X PBS
Premium Cover Glass (22×22 mm No.1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	S36938
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AM	Molecular Probes	C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-076
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot – 1:10000
Tween-20	BioRad	170-6531
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay	BioRad	500-0116
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	BioRad	161-0302
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	161-0158