사이트 특정 복제 막힘의 유도<i> E. 대장균</i> 형광 리프레 운영자 시스템을 사용하여
Summary
We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.
Abstract
밀접하게 결합 단백질과 다양한 병변을 포함하여 DNA에 존재하는 장애물, 심각한 세포의 복제 기계의 진행을 억제 할 수 있습니다. replisome의 실속 복제 포크의 붕괴로 이어지는 염색체의 어느 부분 또는 전체의 해리가 발생할 수 있습니다. 이 붕괴로부터의 복구는 셀에 정확하게 완전한 염색체 복제 및 이후 분할에 대한 필요성이다. 복제를 DNA 포크를 복원하고 수 있도록 자리를 차지할 붕괴가 발생하면 따라서 세포가 진화하고 다양한 메커니즘은 높은 충실도 완료합니다. 이전에, 박테리아에서 이러한 복제 보수 경로는 알려진 위치에 국소 없다는 단점이 UV 손상을 이용하여 연구되었다. 이 원고 실속 복제 FO 붕괴를 유도 할 수있는 부위 특이 단백질의 블록을 생성하는 형광 리프레 조작 시스템 (FROS)을 이용하는 시스템을 개시대장균에서 RKS. 복제 상태는 형광 현미경 및 DNA 복제 중간체를 사용하여 하나의 살아있는 세포에서 가시화 될 수있는 방법을 프로토콜 세부 2 차원 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분석 될 수있다. replisome 성분 (예 DnaBts)의 온도 민감성 돌연변이 복제 포크 동기 붕괴를 유도하는 시스템에 포함될 수있다. 더욱이, 이러한 프로세스에 관련된 재조합 단백질 및 헬리의 역할은이 시스템에서 유전자 녹아웃을 이용하여 연구 할 수있다.
Introduction
DNA 복제 동안 replisome 그 진행을 저해 DNA의 장애물에 직면하고있다. DNA 병변과 간격을 포함한 피해뿐만 아니라 비정상적인 구조는 1 진행에서 replisome를 방지 할 수 있습니다. 최근,이 DNA에 결합하는 단백질 포크 진행 2 복제 장애의 가장 일반적인 원인 인 것으로 밝혀졌다. 핵 단백질 블록과 replisome의 발생에 따라 이벤트의 기술은 이미 공지 된 위치에서 살아있는 세포의 염색체 이러한 블록을 유도하는 무능력에 의해 제한되었다. 시험 관내 분석은 운동 동작에 대한 이해를 강화했다 그것이 핵 단백질 막힘 3뿐만 아니라 4,5- replisome 자체의 기계적인 세부 사항을 충족하는 활성의 replisome. 복제의 수리 현재 이해는 일반적으로 생체 6-8에서 플라스미드 DNA를 사용하여 손상 에이전트로 자외선을 수행하고 연구한다 </s>입니다. 그것은 일반적으로 이러한 연구로부터 이해되는 생체 핵 단백질 블록을 발견 한 후 복제 블록 내의 별개의 원인으로 인해 복구 경로 내에서 분자 수준의 변화가 아직 여전히 존재 여부, DNA의 복구에 관여 할 수있는 단백질 동안 결정한다.
여기서, 우리는 핵 단백질 블록 형광 리프레 조작 시스템 (FROS)를 이용하여 염색체의 특정 위치에 설정 될 수있는 시스템을 설명한다. 우리는 E.의 변형을 이용 염색체에 도입 구 (240) TETO 사이트의 어레이를 갖고 대장균. 어레이 내의 각 TETO 사이트는 어레이 내에 RECA 매개 재결합을 방지함으로써 배열의 안정성을 증가시키기 위해 측면 10 bp의 랜덤 시퀀스를 가진다. 이 배열하고, 그것의 변형이 원래 E.를 이해하는 데 사용 된 대장균 염색체 역학 10,11하지만 preve에 적응했다NT를 생체 내 복제 12. 어레이 안정적 유지하고 TetR (10, 12)에 의해 결합 될 때 복제 포크의 100 %에 가까운 차단하는 것으로 밝혀졌다. 22 사이트 복제의 90 %를 차단하기에 충분한 보유하면서이 짧은 배열 생체 13 덜 효과적 이었지만 체외 유사한 LACO 어레이의 사용은 몇으로 발견했다. 핵 단백질의 차단을 만들 배열을 적용하려면 리프레 서 단백질은 매우 그 다음로드 블록을 만들 배열에 결합 최적화 된 조건 하에서 과잉 생산해야합니다. 테트 리프레의 형광 태그 변형이 사용되는 경우, 막힘의 형성, 및 후속 릴리스는 형광 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있다. 각 셀 복제 상태는 하나의 초점은 상기 어레이의 하나의 복사본 만이 상기 셀 내에 존재하는 다수의 초점 복제 활성을 나타내는 것을 의미한다 본 병소의 수에 의해 표시된다. 이 활성 재핵 단백질 막힘이 replisome 배열을 통해 진행을 위해 충분히 운영자 사이트 TetR의 결합 친 화성을 감소 무상 유도의 추가에 의해 반전 될 때 습곡 사용할 수 있습니다. 리프레 단백질은 여전히 배열 이제 여러 복사본이 가시화 될 수있는 충분히 높은 친화력을 가진 DNA에 결합 할 수있다.
핵 단백질 막힘의 이벤트의 더 복잡한 세부 중성 중립 이차원 아가 로스 겔 전기 영동 및 서던 하이브리드 14-16를 사용하여 발견 될 수있다. 이러한 기술은 인구 전체 DNA 구조의 분석을 허용한다. 잠재적 이벤트 동안 형성되고 복제 중간체는 가시화 될 수 있으며, 수리되지 않은 남아있다. 제한 효소 및 프로브 이용를 변화시킴으로써, 중간체는 어레이 영역뿐만 복제 포크 (17, 18)를 회귀 때 어레이의 업스트림뿐만 가시화 될 수있다. 그만큼회귀는 replisome 해리 이후에 일어난다; 선행 및 후행 초기 스트랜드 사방 DNA 구조 (a 할러데이 접합)에 생성 된 템플릿 가닥 동시에 재 어닐링으로 서로 주형 가닥과 어닐링 분리.
이 블록 (18)을 만나면 복제 포크 안정 아니라고 도시 된 본 시스템. 또한 replisome 부품의 온도 민감성 유도체가 붕괴되면 복제 포크 리로딩 방지하는데 이용 될 수있다. 블록이 설정되면, 스트레인은 replisome의 동기 비활성화 및 재로드의 제어 방지를 보장하기 위해 비 – 허용 온도로 이동시킬 수있다. 이 온도 – 유도 된 비활성화는 주어진 시간에 붕괴 집단 내의 모든 포크를 보장하고 replisome는 DNA를 처리하는 방법, 축소, 어떤 재 요구 될 때 발생하는 평가를 허용DNA 복제 과정을 시작한다.
여기에 설명 된 시스템의 장점은 핵 단백질 블록 완전히 가역적이다; 따라서, 핵 단백질 블록으로부터 복구하는 세포의 능력에 따라야 할 것이다. 세포에 anhydrotetracycline의 첨가는 복제 포크를 진행 할 수있게 꽉 리프레의 결합을 완화되고 세포 생존 능력을 회복. 막힘의 경감은 5 분 후에 중립 중립 이차원 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 가시화, 10 분 이내 현미경으로 할 수있다. 또한, 생존 분석 복제 막힘 회복 및 증식을 계속하는 균주의 능력을 표시 할 수있다.
여기에 설명 된 실험 절차에 사용되는 균주의 유전 적 배경을 변경함으로써, 막힘이 유형 복구 경로를 해명 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].
Materials
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 16922 | Growth media component |
| Sodium Chloride | VWR | 27810.364 | Growth media component |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 92144 | Growth media component |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Growth media component; Potassium buffer component |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | Growth media component; Potassium buffer component |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | For induction of TetR-YFP production |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | Release of replication bloackage |
| Axioskop 2 Fluorescence microscope | Zeiss | 452310 | Visualization of cells |
| eYFP filter set | Chroma Technology | 41028 | Visualization of YFP |
| CCD camera | Hamamatsu | Orca-AG | Visualization of cells |
| MetaMorph Software (Molecular Devices) | SDR Scientific | 31282 | Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | For agarose plugs and gel electrophoresis |
| Original Glass Water Repellent (Rain-X) | Autobarn | DIO1470 | For agarose plug manufacture |
| TRIS | VWR | VWRC103157P | TE, TBE buffer component |
| Ethylene diaminetetraacetic acid | Ajax Finechem | AJA180 | 0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH. |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Bacteriostatic agent |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | TE buffer component |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Cell lysis buffer component |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl) | Sigma-Aldrich | L5125 | Cell lysis and ESP buffer component |
| Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | Cell lysis buffer component |
| Lysozyme | Amresco | 6300 | Cell lysis buffer component |
| Proteinase K | Amresco | AM0706 | ESP buffer component |
| Sub-Cell Model 192 Cell | BioRad | 1704507 | Electrophoresis system |
| UV transilluminator 2000 | BioRad | 1708110 | Visualization of DNA |
| Ethidium Bromide | BioRad | 1610433 | Visualization of DNA |
| Boric acid | VWR | PROL20185.360 | TBE component |
| Hybond-XL nylon memrbane | Amersham | RPN203S | Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used |
| 3MM Whatman chromatography paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030690 | Southern blotting |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | 95-0031-01/02 | Crosslinking of DNA and hybridization |
| Deoxyribonucleic acid from salmon sperm | Sigma-Aldrich | 31149 | Hybridization buffer component |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | Denaturation buffer component |
| Trisodium citrate dihydrate | VWR | PROL27833.363 | Transfer buffer |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Amresco | 227 | Wash buffer component |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Hybridization buffer component |
| Random Hexamer Primers | Bioline | BIO-38028 | |
| Klenow fragment | New England BioLabs | M0212L | |
| dNTP Set | Bioline | BIO-39025 | |
| Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP | PerkinElmer | BLU502A | |
| Storage Phosphor Screen | GE Healthcare Life Sciences | GEHE28-9564-76 | BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Visualization of blot |
| Hybridization bottle | UVP | 07-0194-02 | 35 x 300mm |
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