Inducera en Platsspecifik Replication Blockering i<i> E. coli</i> Med hjälp av en fluorescerande repressor Operator System

Summary

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Abstract

Hinder som förekommer på DNA, inklusive tätt bundna proteiner och olika skador, kan allvarligt hämma utvecklingen av cellens replikering maskiner. Stall av en replisome kan leda till dess dissociation från kromosomen, eller delvis sin helhet, vilket leder till en kollaps av replikationsgaffeln. Återhämtningen från denna kollaps är en nödvändighet för cellen att exakt fullständig kromosomdubbelarbete och därefter dela. Därför, när kollapsen inträffar har cellen utvecklats olika mekanismer som äger rum för att återställa DNA gaffel och tillåta replikering kompletteras med high fidelity. Tidigare har dessa replikeringsreparationsvägar i bakterier studerats med användning av UV-skada, vilket har nackdelen av att inte vara lokaliserad till en känd plats. Detta manuskript beskriver ett system som utnyttjar en Fluorescence repressor Operator System (FROS) för att skapa ett sätesspecifikt proteinblock som kan inducera stall och kollaps av replikering foRKS i Escherichia coli. Protokoll detalj hur status för replikering kan visualiseras i enstaka levande celler med användning av fluorescensmikroskopi och DNA-replikationsmellanprodukter kan analyseras med två-dimensionell elektrofores på agarosgel. Temperaturkänsliga mutanter av replisome komponenter (t.ex. DnaBts) kan införlivas i systemet för att inducera ett synkront kollaps av replikationsgafflar. Dessutom kan roller rekombinationsproteiner och helikaser som är inblandade i dessa processer studeras med hjälp av genetiska knockouts i detta system.

Introduction

Under DNA-replikation, vänd mot replisome hinder på DNA som försämrar dess utveckling. DNA-skador, inklusive skador och brister samt avvikande strukturer kan hindra replisome från att fortsätta ^en. Nyligen har det visat sig att proteiner bundna till DNA är den vanligaste källan till hinder för replikationsgaffeln progression ^2. Kunskapen om händelserna efter mötet i replisome med ett nukleoprotein block har tidigare begränsats av oförmågan att framkalla ett sådant block i kromosomen hos en levande cell på en känd plats. In vitro-analys har ökat vår förståelse av den kinetiska beteende av en aktiv replisome när den möter ett nukleoprotein blockering ^3, liksom de mekanistiska detaljerna i replisome sig ^4,5. Aktuell kunskap om reparation av replikering är i allmänhet genomförs med UV som skadliga medlet och studeras med hjälp av plasmid-DNA in vivo ^6-8 </supp>. Medan de proteiner som kan vara inblandade i reparation av DNA efter den stöter på ett in vivo nukleoprotein blocket i allmänhet förstås från dessa studier, om det finns variationer i de molekylära händelser inom reparationsvägar på grund av den distinkta orsaken i replikeringsblocket fortfarande ännu att vara bestämd.

Här beskriver vi ett system som tillåter ett nukleoprotein block som skall etableras i ett visst läge av kromosomen med hjälp av en fluorescerande repressor Operator System (FROS). Vi använder en stam av E. coli som har haft en rad 240 Teto platser som ingår i kromosom ^9. Varje tetO ställe inuti matrisen har en 10 bp slumpmässig sekvens som flankerar den för att öka stabiliteten hos arrayen genom att förhindra RecA-medierad rekombination inom arrayen. Denna grupp, och varianter av det, ursprungligen användas för att förstå E. coli-kromosomen dynamik ^10,11 men sedan anpassas till Prevent in vivo replikation ^12. Matrisen har visat sig vara stabilt upprätthållas och för att blockera nära 100% av replikationsgafflar när den är bunden av TetR ^10,12. Användningen av liknande lacO array in vitro har funnit så få som 22 platser var tillräcklig för att blockera 90% av replikation, även om detta kortare array var mindre effektivt in vivo ^13. Att anpassa uppsättningen för att skapa ett nukleoprotein blockering, måste repressor-proteinet i hög grad överproduceras under optimerade betingelser där den sedan binder till matrisen för att skapa en spärr. Bildandet av blockeringen, och dess efterföljande frisättning, kan övervakas genom användning av fluorescensmikroskopi om en fluorescensmärkta variant av Tet-repressor används. Statusen för replikation i varje cell indikeras av antalet foci sett, där en enda kontaktpunkt betyder bara en kopia av uppsättningen är närvarande i cellen och flera härdar indikerar aktiv replikation. Denna aktiva relämpning är aktiverad när nukleoproteinet blockering reverseras genom tillsats av omotiverade inducerare som minskar bindningsaffiniteten hos TetR för operatören platsen tillräckligt för replisome fortgå genom uppsättningen. Repressorproteinet är fortfarande i stånd att binda till DNA med tillräckligt hög affinitet att de nu flera kopior av matrisen kan visualiseras.

Mer intrikata detaljer om händelserna på nukleoprotein blockering kan upptäckas med hjälp av neutral-neutral tvådimensionell agarosgelelektrofores och Southern hybridisering ^14-16. Dessa tekniker tillåter analys av DNA-strukturer över befolkningen. Replikerings intermediärer som bildas under evenemanget, och potentiellt förblir oreparerade kan visualiseras. Genom att variera restriktionsenzym och prob utnyttjas, kan mellanprodukterna visualiseras inte bara i arrayen regionen men även uppströms av arrayen när replikationsgaffeln regresses ^17,18. Deregression sker efter det att replisome dissociation; de ledande och eftersläpande begynnande strängar separat från mallsträngarna och glödgning till varandra som mallsträngarna samtidigt åter glödga som resulterar i en fyrvägs DNA-strukturen (en Holliday korsning).

Med användning av detta system har det visats att den replikationsgaffeln inte är stabil när den stöter detta block ^18. Dessutom kan temperaturkänsliga derivat av replisome komponenter utnyttjas för att förhindra omlastning av replikationsgaffeln när den har kollapsat. När ett block är etablerad, kan den stam förskjutas till en icke-permissiv temperatur för att säkerställa en synkron avaktivering av replisome och en reglerad förebyggande av omlastning. Denna temperatur-inducerad deaktivering garanterar alla gafflarna inom befolkningen har kollapsat vid en given tidpunkt och möjligt att bedöma vad som händer när replisome kollapsar, hur DNA bearbetas, och vad som krävs för att återstarta processen med DNA-replikation.

En fördel med systemet som beskrivs här är att nukleoprotein blocket är helt reversibel; Därför är förmågan hos cellerna att återhämta sig från nukleoproteinet blocket kunna följas. Tillsatsen av anhydrotetracyklin till cellerna kommer att lindra den snäva bindning av repressom, vilket gör att en replikationsgaffeln att gå igenom och cellen att återfå lönsamhet. Lindring av blockeringen kan visualiseras genom neutral-neutral två-dimensionell elektrofores på agarosgel efter 5 min och genom mikroskopi inom 10 min. Vidare kan livskraft analys avslöjar förmågan hos stammen att återhämta sig från replikerings blockering och fortsätter att proliferera.

Genom att ändra den genetiska bakgrunden till de stammar som användes i det experimentella förfarande som beskrivs här, kan de reparationsvägar för denna typ av blockering att belysas.

Protocol

1. Blockering replikering med FROS Induktion replikerings Blockering Späd en färsk nattgammal kultur av en E. coli-stam som bär en tetO array och pKM1 18 till OD 600 nm = 0,01 i en utspädd komplext medium (0,1% trypton, 0,05% jästextrakt, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) med antibiotika efter behov för val. Obs: Lägg inte till tetracyklin för val eftersom det inte är förenligt med detta s…

Representative Results

Den FROS är en inducerbar, platsspecifik nukleoprotein block som möjliggör replikationsintermediärer som skall visualiseras i levande celler 12,18. En allmän experimentell design för provtagning celler illustreras i figur 1. Tidpunkten för provtagning och variationer i genetisk bakgrund gör detta ett mångsidigt system för att studera reparation av ett sådant block. Den schematiska illustrerar hur temperaturkänsliga mutanter, såsom DnaB ts…

Discussion

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded^20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo…

Materials

Tryptone	Sigma-Aldrich	16922	Growth media component
Sodium Chloride	VWR	27810.364	Growth media component
Yeast extract	Sigma-Aldrich	92144	Growth media component
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786	Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919	Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope	Zeiss	452310	Visualization of cells
eYFP filter set	Chroma Technology	41028	Visualization of YFP
CCD camera	Hamamatsu	Orca-AG	Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices)	SDR Scientific	31282	Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose	Bioline	BIO-41025	For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	For agarose plug manufacture
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid	Ajax Finechem	AJA180	0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	TE buffer component
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	Cell lysis buffer component
Lysozyme	Amresco	6300	Cell lysis buffer component
Proteinase K	Amresco	AM0706	ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	Electrophoresis system
UV transilluminator 2000	BioRad	1708110	Visualization of DNA
Ethidium Bromide	BioRad	1610433	Visualization of DNA
Boric acid	VWR	PROL20185.360	TBE component
Hybond-XL nylon memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm	Sigma-Aldrich	31149	Hybridization buffer component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate	VWR	PROL27833.363	Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Amresco	227	Wash buffer component
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers	Bioline	BIO-38028
Klenow fragment	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Storage Phosphor Screen	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualization of blot
Hybridization bottle	UVP	07-0194-02	35 x 300mm