The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.
Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.
Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.
Ett kritiskt steg i denna bakteriearter konkurrens protokoll som skiljer den från andra, är den natten inkubation av inhibitor isolera före tillsats av konkurrentens isolat. Stammen hämmare kräver denna tillväxtperiod för att producera hämmande föreningar. Som den tävlande stammen överlagras ovanpå samma medium medger denna metod att forskaren att observera den fulla potentialen av stammen inhibitorn att störa tillväxten av konkurrent-stammen. Som ett resultat, reflekterar denna analys vad som händer med naturen; ett isolat är fullt etablerad i en nisch, och andra måste kunna motverka eventuella hämmande variabler för att kunna framgångsrikt invadera nisch.
Det finns två delar i detta protokoll som är mest sannolika att orsaka felaktiga resultat om de utförs felaktigt. För det första kan ofullständig sterilisering av förångaren flaskor införa kontaminerande bakterier in analysen. Incubation av buljongen användes för att skölja förångaren flaskan i steg 3,6 i en steril kärl kan användas för att bekräfta flaskorna helt steriliseras. Ytterligare tvättar i desinficerande lösningar, såsom Virkon kan användas innan tvätten i ytaktivt rengöringsmedel, som beskrivs i steg 3,2, om ytterligare sterilisering krävs.
Ett andra steg som kan leda till felaktiga resultat är utspädningen av den tävlande stammen (steg 6,1). Om utspädnings inte är optimal, tydliga mätningar av hämning kan inte lätt bestämmas. Denna analys optimerades med hjälp av olika nasala isolat som inhibitor-producerande stammar över ett brett spektrum av grampositiva och gramnegativa arter jämfört med S. aureus SH1000 som konkurrenten stammen 7,8. Det har därefter testats med olika koagulasnegativa negativa och koagulaspositiva stafylokocker som konkurrent och stammar inhibitor-producerande. Vid testning av andra än de som beskrivs ovan som konkurrenten släktenstammen, kan en viss optimering av utspädningen för inokulatet vara nödvändig.
Om klarhet poäng varierar kraftigt mellan upprepningarna, kan det vara nödvändigt att standardisera konkurrenten stammen inokulatet genom att ställa in en specifik optisk densitet. Detta kommer dock att öka den tid analysen tar att ställa upp, och kommer sannolikt att minska antalet stammar är det möjligt att bearbeta per experiment. Visuellt justera kulturen till en lämplig OD med hjälp av en McFarland standard kan ge en snabb alternativ.
En begränsning med denna teknik är att det endast kan tillämpas på odlingsbara bakterier. Det är därför många studier använder 16S rRNA-sekvensering för att förutsäga konkurrenskraftiga uteslutnings interaktioner 3,4,13. Däremot kan genetiska och metagenomic tekniker endast skilja samhällsmedlemmar till artnivå och / eller tar inte hänsyn till särskilt inomarts egenskap variation. Det är möjligt att screena för föreningen av en particular gen som kodar för ett drag med närvaron eller frånvaron av en bakterieart 5, men detta förutsätter förkunskaper av en gen sannolikt att förknippas med uteslutning av en art.
En säkerhets övervägande av denna teknik är att, på grund av alstrandet av bakterier aerosol, det kan endast användas i laboratorier med en nivå två säkerhetsbänk, eller med liknande säkerhetsåtgärder. Det finns alternativa metoder för att testa för konkurrens mellan isolat som står för intraspecifika drag variation och inte genererar aerosoler av bakterier. En sådan metod är den samtidiga antagonism-analysen 2. I denna metod, är ett inokulum av ett isolat spreds på en agarplatta, och ett andra isolat inokulatet spotted eller hackat ovanpå när den första har torkat. Detta skulle ge en miljö där stammarna är i direkt konkurrens (samtidig antagonism), båda tävlar om att producera hämmande föreningar och rensar näringsämnen först. den advantage av den uppskjutna tillväxtinhibitionsanalys över den samtidiga antagonism-analysen är att hämmaren isolat alltid ska ha konkurrensfördelar av att vara fullt etablerad före invasionen av konkurrentens isolat. Detta är mer reflekterande av vad som skulle hända i miljön, som i de flesta nischer, kommer ett isolat fastställas innan en annan stam tillsätts i stället för två isolat läggs samtidigt 8.
Ett annat alternativ för att undvika aerosolbildning av bakterier skulle vara att lägga den tävlande isolera i toppagar, vilket kan hällas i stället sprutas över inhibitorn isolatet. Skulle emellertid volymen av toppagar tillsätts måste vara ca 3 ml för att säkerställa jämn täckning av plattan. Inom denna volym skulle konkurrent isolat inte växer på samma media som hämmaren isolat, så skulle inte drabbas av minskade näringsämnen. Den tävlande skulle heller inte vara i direkt kontakt med eventuella inhiberande föreningarna until de sprids i den övre agar. En sådan analys kan inte beskrivas som uppskjuten hämning eller samtidig antagonism.
En liknande metod har tidigare använts för att bedöma nivåerna av bacitracin motstånd bland kliniska S. aureus-isolat 10. Den största skillnaden mellan det protokoll som beskrivs här och som beskrivs av 10, är den senare bara klassificerade konkurrent stammar som känsliga (komplett inhibition- klarhet poäng 0) eller resistenta (partiell eller ingen inhibition- klarhet poäng 1-5). Den uppskjutna tillväxtinhibitionsanalys kan därför också användas för att screena för nivåer av resistens mot producenter av vissa antimikrobiella medel, eller till och med för att söka efter nya antimikrobiella medel verksamma mot multiresistenta patogener.
Det har föreslagits att värdmikrofloran kunde manipuleras för att eliminera icke önskvärda medlemmar av den bakteriella gemenskap 9. Tillämpning av Corynebacteria eller Staphylococcus epidermidis har redan visat sig eliminera S. aureus kolonisering i näsborrarna i en betydande andel av befolkningen 11,12. Studier specifika stammar som konkurrenskraftigt kan utesluta oönskade medlemmar i värd flora, genom tekniker såsom den som beskrivs här, kan därför leda till framtida läkemedel.
The authors have nothing to disclose.
JCM finansieras av en BBSRC-IPA tilldelning med Unilever Plc (BB / L023040 / 1). HAG finansieras av en saudiska ministeriet för högre utbildning doktorand.
Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
plastic perfume vaporizer | not known | – | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |