Procédure d'adaptation Laboratoire de l'évolution de Microorganismes Utilisation chémostat
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour obtenir adaptatif évolution en laboratoire de micro-organismes dans des conditions à l'aide de la culture chemostat. En outre, l'analyse génomique de la souche évoluée est discutée.
Abstract
Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.
Introduction
Les microorganismes peuvent survivre et s'adapter à des environnements divers. En cas de stress sévère, l' adaptation peut se produire via l' acquisition de phénotypes bénéfiques par des mutations génomiques aléatoires et la sélection positive ultérieure 1-3. Par conséquent, les cellules microbiennes peuvent adapter en changeant métabolique ou les réseaux de régulation pour une croissance optimale, qui est appelé «l'évolution adaptative". tendances microbiennes importantes récentes, telles que les épidémies de superbactéries et l'apparition de souches microbiennes robustes, sont très étroitement liés à l'évolution adaptative dans des conditions stressantes. Dans des conditions de laboratoire définies, nous sommes en mesure d'étudier les mécanismes de l'évolution moléculaire et même de contrôler la direction de l'évolution microbienne pour diverses applications. Contrairement à des organismes multicellulaires, les organismes unicellulaires sont bien adaptés à l'évolution de laboratoire adaptatif (ALE) pour les raisons suivantes: ils régénèrent rapidement, ils maintiennent des populations importantes, et il est facile de créer et maintenir homenvironnements ogeneous. Combiné avec les récentes avancées dans les techniques de séquençage de l'ADN et des technologies à haut débit, ALE permet l'observation directe des changements génomiques qui conduisent à des changements réglementaires systémiques. la dynamique de mutation et la diversité de la population sont également observables. Stratégies de génie génétique peuvent être déterminées à partir de l'analyse des souches d'ale 4,5.
Culture Chemostat est une méthode utilisée pour obtenir des cellules à l' état stable et d' augmenter la productivité dans les processus de fermentation 6. Du milieu frais est ajouté et le bouillon de culture est récolté pendant le processus (celui-ci comprend en moyenne et la biomasse). Culture chemostat à long terme, cependant, modifie la productivité à l' état stable de la culture et provoque l'accumulation de mutations spontanées et la sélection lors de la culture (figure 1a). Sous diverses pressions de sélection (facteurs de stress), l'accumulation de mutations est améliorée. Une augmentation progressive de stress dans un long terme chémostat prévoit une sélection continue de mutations qui agissent contre les facteurs de stress donnés, tels que la température, le pH, la pression osmotique, des substances nutritives inanition, l' oxydation, des produits finaux toxiques, etc. , le transfert des colonies à partir d' un milieu solide et le transfert en série à partir d' un milieu liquide (répété culture discontinue) permettent également aux chercheurs d'obtenir des micro – organismes évolués (figure 1b et 1c). Bien que la culture chemostat nécessite des méthodes compliquées, la piscine de la diversité (nombre de répétitions et de la taille de la population) est supérieure à celle obtenue par transfert des colonies et des techniques de transfert de série. L'exposition au stress stable à des cellules individuelles et une diminution de la variation de l'état cellulaire pendant la culture chemostat (état stable) sont les autres avantages de l'ALE par rapport aux techniques basées sur la culture par lots. ALE Le stress induit par des Escherichia coli soumis à des conditions succinate élevées est introduit dans cet article.
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Figure 1: Méthodes d'évolution de laboratoire adaptatif (A) Chemostat;. (B) transfert en série; (C) transfert des colonies. Les chiffres supérieurs illustrent le concept des méthodes pour ALE, et les chiffres inférieurs illustrent le nombre de cellules qui se sont développées au cours ALE. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les microorganismes sont capables d'adapter à presque tous les environnements en raison de leur taux de croissance rapide et de la diversité génétique. évolution de laboratoire Adaptive permet des micro-organismes à évoluer dans des conditions conçues, ce qui fournit un moyen de sélectionner les organismes individuels hébergeant des mutations spontanées qui sont bénéfiques dans les conditions données.
La technique de chemostat est plus robuste pour réaliser l'évolutio…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).
Materials
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | – | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | – | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
References
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