células-tronco neurais (NCCC) referem-se a células que podem auto-renovar e diferenciar em três linhagens neurais. Aqui, descrevemos um protocolo para determinar a freqüência NSC em uma população de células determinado usando neurosphere formação e diferenciação em condições clonais.
células-tronco neurais (NCCC) têm a capacidade de se auto-renovar e gerar os três principais linhagens neurais – astrócitos, neurônios e oligodendrócitos. NSC e progenitores neurais (PN) são comumente cultivados in vitro como neurospheres. Este protocolo descreve em detalhes como para determinar a frequência NSC em uma determinada população de células sob condições clonais. O protocolo começa com a inoculação das células a uma densidade que permite a geração de neuroesferas clonais. As neuroesferas são então transferidos para lamelas septadas e diferenciadas em condições clonais em meio condicionado, o que maximiza o potencial de diferenciação das neuroesferas. Finalmente, a frequência NSC é calculado com base nas capacidades de formação e multipotency neuroesferas. Utilidades deste protocolo incluem a avaliação dos candidatos marcadores NSC, purificação da NSC, e a capacidade de distinguir NSCs de NPS. Este método leva 13 dias para executar, o que é muito sHorter que os métodos atuais para enumerar frequência NSC.
As células estaminais neurais (NCCC) são células do sistema nervoso central (SNC), que pode se auto-renovar e são multipotentes. NSC são primeiro especificado durante o desenvolvimento do prosencéfalo embrionário e continuam a persistir no cérebro adulto em regiões específicas, tais como a zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais e o giro dentado (DG) do hipocampo. Um número de linhas NSC estão sendo usados em ensaios clínicos para o tratamento de acidente vascular cerebral e outras doenças neurológicas, como a doença 1 de Batten.
NSC e progenitores neurais (PN) são propagadas em cultura como estruturas flutuantes em 3 dimensões esferóides chamados neurospheres. O sistema de cultura de neuroesferas foi desenvolvido por Reynolds e Weiss no início de 1990, quando se verificou que as células corticais embrionárias e adultos poderia dividir na presença de factor de crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) 2-4. Neurospheres consistem em uma mistura heterogênea de cells composto de subclasses em diferentes estágios de desenvolvimento 5. É um desafio para estudar especificamente NSCs utilizando dados obtidos a partir neurospheres devido à presença de PN. Por isso, é crucial para enriquecer NSCs a partir neurospheres. Actualmente, quatro principais métodos têm sido utilizados para enriquecer para NSC in vitro. Primeiro, é a utilização de marcadores de superfície celular. Lewis-X (LeX) e CD133 (também conhecido como Prominin1) são a superfície da célula mais proeminente NSC marcadores 6-9. Sindecam-1, Notch-1 e integrina-beta1 são outras proteínas de superfície que enriquecem por NSCs 10. O segundo é a exclusão do corante. Tem sido demonstrado que as células lado populacionais, que têm a capacidade única para bombear o corante de ligação a ADN fluorescente Hoechst 33342, são enriquecidas para as NSC 11. A terceira é a utilização de uma selecção morfológica. Tem sido demonstrado que as células com o aumento do tamanho celular e granularidade abrigar mais NSC do que os seus homólogos 5,12,13. Quarta é a adição de NSC sufactores rvival para o meio de cultura. Tem sido demonstrado que a adição de sulfato de condroitina proteoglicano e apolipoproteína E melhora a sobrevivência NSC e, assim, aumenta a frequência NSC 14,15. Embora muitos marcadores, incluindo factores de transcrição têm sido associados com as NSC 16,17, nenhum destes marcadores são capazes de enriquecer as NSC à pureza. Devido à falta de marcadores definitivos NSC, que continua a ser um desafio para quantificar as NSC e distingui-las das NPs in vitro.
Os estudos iniciais usou o ensaio de formação de neurosphere (NFA) para quantificar NSCs 7,11,13. Neste ensaio, as células dissociadas são cultivadas para formar neuroesferas e o número de neuroesferas gerado por cada 100 células plaqueadas é determinada. Este valor é denominado como Unidade de Formação da Neurosphere (NFU). A NFU é igual à frequência NSC se todas as neuroesferas surgir a partir de NSC. No entanto, foi demonstrado que a NFU sobrestima a frequência NSC como neuroesferas são formados por ambos os NSCs e início de NPs 5. Assim, é imprecisa para enumerar NSCs exclusivamente com base na formação neurosphere. Poderia ser possível quantificar NSCs base na sua capacidade de auto-renovação, proliferam extensivamente e gerar neurospheres multipotentes.
NSC, que são EGF e bFGF responsivo, normalmente sobreviver por pelo menos dez passagens e, assim, exibir grande capacidade de auto-renovação na cultura 4,18-20. PN, que são EGF e bFGF responde bem, também poderia gerar neurospheres para algumas passagens, mas não para um longo período de tempo. Por isso, tem sido amplamente aceito que NSCs de boa fé podem ser enumerados, com precisão justa, com base na formação neurosphere por pelo menos dez passagens. Na maioria dos estudos, no entanto, de auto-renovação é geralmente medido com base na formação neuroesfera secundário ou terciário, devido ao tempo necessário para experimental longo de dez passagens. Assim, o NFA secundária pode ser utilizado para comparar a aposta largamente a capacidade de auto-renovaçãopopulações ween, mas não podem ser usadas para enumerar com precisão a frequência NSC.
NSCs têm uma maior capacidade proliferativa em comparação com NPS. Esta propriedade do NSC foi usada por Louis et al. para desenvolver um ensaio para a enumeração NSC – o ensaio neural de formação de colónias de células (NCFCA) 21,22. Neste ensaio, células isoladas são cultivadas durante 3 semanas em uma matriz semi-sólida contendo colagénio. Sob estas condições de cultura, mostrou-se que as células que formam neuroesferas acima de 2 mm de diâmetro são tripotent e pode auto-renovação por longo prazo. Estas células são definidos como NSC. Portanto, as NSC são eficazmente distinguido de PN.
NSC têm a capacidade de se diferenciar em astrócitos, oligodendrócitos e neurónios. Para a diferenciação de neuroesferas, factores de crescimento e soro são removidos é adicionado ao meio de cultura. Se todas as três linhagens neurais são observadas num neuroesfera, em seguida, a célula que iniciou que neuroesfera is uma NSC. No entanto, o ensaio de diferenciação tem algumas limitações. Em primeiro lugar, as condições de cultura utilizadas para a diferenciação pode não ser óptimo para a geração de todas as três linhagens neurais. De fato, em um único processo de diferenciação neurosphere, morte celular significativa ocorre e, principalmente, geração de astrócitos ocorre (Tham M e Ahmed S, não publicado). Em segundo lugar, há a questão de clonalidade. Para a enumeração precisa da NSC, a formação e a diferenciação das neuroesferas tem que ser realizada sob condições clonais, em que cada neuroesfera surge de uma única célula. Em culturas de suspensão em massa, a agregação ocorre em ambos os níveis celulares e neuroesferas 23-25. Portanto, é possível para cada neuroesfera a surgir a partir de várias células ou neuroesferas, o que complica a contagem e avaliação de multipotência neuroesfera. Evidências recentes mostram que a agregação de células não ocorre a baixa densidade de revestimento de 0,5 células / mL ou abaixo, e quando placas de cultura não são movidos durante neuformação rosphere 15. Assim, a cultura de células de baixa densidade tal iria assegurar a clonalidade.
Atualmente, o NCFCA é o método mais comumente usado para distinguir NSCs de NPs e enumerar frequência NSC. O NCFCA, no entanto, requer um tempo relativamente longo de três semanas. Aqui, descrevemos um protocolo para enumerar frequência NSC com base na capacidade de NSCs para formar neurospheres multipotentes. Este protocolo leva apenas 13 dias para executar. A clonalidade NCFCA assegura que a matriz de colagénio impede o movimento das neuroesferas. As condições de cultura utilizadas neste protocolo também permite clonalidade para ser mantida durante todo. Por exemplo, o uso de 50 poços lamelas de câmaras assegura que as neuroesferas irá diferenciar sem contacto uma com a outra. Além disso, usar o meio que fornece factores neurotróficos durante a diferenciação para maximizar o potencial de diferenciação das neuroesferas (Figura 1) condicionado.
Descrevemos hee a enumeração de NSCs em condições clonais. As etapas críticas incluem a utilização de meio de crescimento e diferenciação NSC fresco, e também o uso da solução de PLL / laminina recentemente preparada para revestir as lamelas de câmaras, bem como as placas de cultura. Isso garante condições de crescimento e diferenciação ótimas de neurospheres. A utilização de anticorpos de boa qualidade para detectar eficazmente os neurónios e glia, bem como a colheita selectiva de neuroesferas clonais que não estão em contacto com outros neuroesferas, são críticos. Além disso, é importante para assegurar as neuroesferas escolhidas não secam. Recomenda-se adicionar 10 pL de meio de diferenciação em cada poço após a colheita cada 10 neuroesferas. É importante a utilização de uma lamela compartimentado em um prato de 10 cm por exemplo para evitar conversas cruzadas entre diferentes amostras de neuroesferas. Se duas lamelas (cada um contendo a partir de neuroesferas amostras diferentes) são colocados namesma placa de 10 cm, neurospheres de uma lamela pode liberar fatores que podem alterar a propensão dos neurospheres na outra lamela de se diferenciar em linhagens específicas. Duas lamelas na mesma placa de 10 cm pode também resultar em mistura entre amostras.
No caso de a NFU ou a frequência NSC é menor do que o esperado, garantir que o número baixo de passagem neurospheres são usados. É também importante que saudáveis neuroesferas baixa passagem são utilizados para gerar o meio condicionado. Em seguida, se as neuroesferas são cultivadas em poços com pequeno diâmetro, tal como em 96 poços prato, então será mais difícil de manobrar e escolher neuroesferas utilizando uma micropipeta. Neste caso, as neuroesferas transferir para um prato de cultura maior, tal como um prato de 6 poços, antes da colheita. Alguns dos neurospheres escolhidos podem levantar da lamela chambered durante a cultura e imunocoloração. Minimizando o movimento da lamela septadas durante a cultura, e menos lavagem intensivaing durante a imunocoloração, ajudaria a evitar o destacamento de neurospheres.
Estudos iniciais quantificados NSCs usando apenas a NFA 7,11,13. No entanto, a NFA superestima a freqüência NSC como ambos NSCs e início NPs gerar neurospheres 5. Louis et ai. Desenvolveram um outro método para quantificar as NSC conhecido como o NCFCA 21,22. O NCFCA envolve a cultura de células isoladas numa matriz à base de colagénio para assegurar a clonalidade, e foi mostrado que neuroesferas acima de 2 mm de diâmetro são formadas por apenas NSC. Semelhante ao NCFCA, clonalidade é assegurada durante todo esse protocolo. Isto é conseguido através da geração de neuroesferas com uma densidade clonal e a diferenciação das neuroesferas em lamelas de câmaras. A utilização de lamelas septadas confere um número de vantagens. A lamela câmaras permite que cada neurosphere amostra para diferenciar sem ter contato físico com outros neurospheres amostra, garantindo assim clonalidade durante a diferenciação.A lamela câmaras podem ser colocados em suspensão no meio de diferenciação para permitir que as neuroesferas amostra a ser continuamente condicionado e para assegurar a diferenciação máxima. Na ausência de meio condicionado e soro durante a diferenciação, a sobrevivência das neuroesferas diminui e as neuroesferas principalmente gerar astrócitos (Tham M e Ahmed S, não publicado). Além disso, as neuroesferas imunocoradas pode ser convenientemente armazenado por um longo período de tempo e as lamelas de câmaras pode ser montado directamente sobre as lâminas de vidro de microscópio. Além disso, a imagem latente dos neurospheres imunocoradas é feita fácil como se pode localizar rapidamente o neurosphere na pequena bem compartimentado, capturar uma imagem, e passar para a próxima também.
Nós determinamos a freqüência NSC em E14.5 cultura rato neurosphere usando tanto o protocolo descrito neste manuscrito 27 e NCFCA 28. A freqüência NSC em neurospheres rato E14.5 determinado tanto methods são comparáveis. O NCFCA enumera as NSC que são multipotentes e têm capacidade de auto-renovação a longo prazo. Como a freqüência NSC do nosso método é comparável à de NCFCA, a leitura do nosso protocolo não parece superestimar a freqüência NSC. O NCFCA requer três semanas para ser concluída e, principalmente, envolve plaqueamento celular e reposição médio. O protocolo aqui descrito requer 13 dias de executar e envolve uma série de passos diferente, por exemplo, colheita de neuroesfera e imunocoloração. Este protocolo pode servir como um método alternativo para enumerar NSC. Os pesquisadores podem usar tanto NCFCA e este protocolo para verificar a frequência NSC em suas amostras.
Uma limitação deste protocolo é que uma série de passos importantes têm de ser todos realizados no dia 8. A preparação do meio condicionado, a determinação do NFU de neurospheres amostra e transferência de neurospheres de exemplo para a lamela 50 poços Chambered tem que ser realizada sobre day 8. Pode levar algum tempo para concluir essas etapas. Além disso, requer a prática de realizar estes passos de uma maneira eficiente.
Neurospheres têm sido amplamente utilizados para estudar a função e comportamento NSC. No entanto, neurospheres consistem em ambas as NSCs e NPS. Por isso, é importante para enriquecer a partir de neuroesferas NSC para estudar a biologia NSC. Actualmente, marcadores de superfície celular, de propriedades de exclusão de corante assim como o tamanho celular e granularidade foram usadas para enriquecer para NSC 6,7,9-13,29,30. Este protocolo pode ser usado para quantificar o enriquecimento de NSCs por potenciais marcadores NSC, e para facilitar a busca por um marcador NSC definitiva. Quatro estudos recentes têm utilizado este protocolo para enumerar NSC frequência 5,14,15,26.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa (A * STAR), Cingapura para financiar esta investigação.
15 ml conical centrifuge tubes | BD | 352096 | |
50 ml conical centrifuge tubes | BD | 352070 | |
20 ml sterile syringe | BD | 300141 | |
50 ml sterile syringe | BD | 300144 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
Mouse anti-Tuj1 IgG2a antibody | Covance | MMS-435P-100 | |
Rabbit anti-GFAP IgG antibody | Dako | Z033401 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
Microscope fitted to laminar flow hood | Leica | MZ6 | |
Glass slides | Marienfeld-superior | 1000200 | |
Mouse anti-O4 IgM antibody | Merck Millipore | MAB345 | |
Hydromount | National Diagnostics | HS-106 | |
Microscope | Nikon Eclipse | TS100-F | |
Laminar flow hood | NuAire | NU-543 | |
96-well culture dishes | NUNC | 167008 | |
10-cm culture dishes | NUNC | 150350 | |
Paraffin film | Parafilm | PM999 | |
Human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
0.2 µm filter | Sartorius Stedim | 16534-K | |
0.45 µm filter | Sartorius Stedim | 16555-K | |
1.0 N Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S2770 | |
1.0 N Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
Paraformaldehyde (PFA) powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Toxic |
Bovine serum albumin (BSA) powder | Sigma-Aldrich | A7906 | |
50-well chambered coverslips | Sigma-Aldrich | C7735 | |
Stir plate with heat function | Stuart | UC152 | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
1x phosphate buffered saline without Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | A21042 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific | A21135 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG antibody | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
Cell culture centrifuge | Thermo Fisher Scientific | RT1 75002383 | |
Pasteur pipettes | Thermo Fisher Scientific | 10006021 | |
CO2 incubator | |||
Ventilated fume hood | |||
Aspirator | |||
Confocal microscope | |||
Micropipettes | |||
Micropipette tips | |||
Plastic pipettes | |||
Multichannel pipettes | |||
Glass beaker | |||
Sterile forceps | |||
pH meter |