Micromodelage et l'Assemblée des microvaisseaux 3D
Summary
Ce manuscrit présente un procédé de moulage par injection pour concevoir des microvaisseaux qui récapitulent les propriétés physiologiques de l'endothélium. Le procédé à base microfluidique crée des réseaux vasculaires 3D de brevet avec conditions, adaptable telles que le débit, la composition cellulaire, la géométrie, et les gradients biochimiques. Le procédé de fabrication et des exemples d'applications possibles sont décrites.
Abstract
Dans les plates – formes in vitro pour étudier les cellules endothéliales et la biologie vasculaire sont largement limitées à 2D culture de cellules endothéliales, l' écoulement des chambres avec un polymère ou des substrats de verre à base, et des essais de formation de tube à base d' hydrogel. Ces essais, tandis que d'information, ne récapitulent la géométrie lumière, matrice extracellulaire appropriée, et la proximité multi-cellulaire, qui jouent un rôle clé dans la modulation de la fonction vasculaire. Ce manuscrit décrit un procédé de moulage par injection pour produire des navires d'ingénierie avec des diamètres de l'ordre de 100 um. Microvaisseaux sont fabriqués par ensemencement des cellules endothéliales dans un canal microfluidique intégré dans un type natif du collagène hydrogel. En incorporant des cellules parenchymales dans la matrice de collagène avant la formation de canal, des micro-environnements spécifiques de tissus peuvent être modélisés et étudiés. modulations supplémentaires de propriétés et les médias hydrodynamique composition permettent un contrôle de la fonction vasculaire complexe dans le microenvironnement désiré.Cette plate-forme permet l'étude du recrutement de cellules périvasculaires, des interactions de sang endothélium, la réponse de l'écoulement, et les interactions avec les tissus microvasculaire. microvaisseaux Engineered offrent la possibilité d'isoler l'influence des composants individuels d'une niche vasculaire et de contrôler précisément ses produits chimiques, et des propriétés biologiques mécaniques pour étudier la biologie vasculaire à la fois la santé et de la maladie.
Introduction
La microvascularisation dans chaque organe contribue à définir le microenvironnement des tissus, maintenir l' homéostasie tissulaire et régulent l' inflammation, la perméabilité, la thrombose, et de la fibrinolyse 1,2. Endothelium microvasculaire, en particulier, est l'interface entre le débit sanguin et le tissu environnant et donc joue un rôle essentiel dans la modulation de la fonction vasculaire et de l' organe en réponse à des stimuli tels que les forces hydrodynamiques et les cytokines et les hormones circulantes 3 - 5. La compréhension des interactions entre les détails de l'endothélium, le sang et le tissu environnant microenvironnement est importante pour l'étude de la biologie vasculaire et la progression de la maladie. Cependant, les progrès dans l' étude de ces interactions a été entravée par limitées dans les outils in vitro qui ne récapitulent pas dans la structure microvasculaire vivo et fonctionnent 6,7. En conséquence, le champ et le progrès thérapeutique a beaucoup compté sur coûteuse et longueconsommant des modèles animaux qui ne parviennent pas souvent à traduire le succès chez les humains 8 – 10. Alors que les modèles in vivo sont précieux dans l'étude des mécanismes de la maladie et les fonctions vasculaires, elles sont complexes et manquent de contrôle précis de l' individu cellulaire, biochimique, et les indices biophysiques souvent.
Vascularisation dans tout le corps possède une structure hiérarchique d' âge mûr en conjonction avec des lits capillaires expansives, fournissant perfusion optimisée et le transport des nutriments simultanément 11. Dans un premier temps , les formes de vascularisation comme un plexus primitif qui réorganise à un réseau hiérarchisé ramifié au début du développement 12,13. Bien que plusieurs des signaux impliqués dans ces processus sont bien compris 14 – 16, il reste insaisissable comment une telle structuration vasculaire est déterminé 15. À son tour, récapitulant ce processus in vitro pour concevoir des réseaux vasculaires organisés a been. De nombreuses plates – formes existantes difficiles in vitro pour modéliser le système vasculaire, par exemple deux cultures de cellules endothéliales dimensions, manquent des caractéristiques importantes telles que la proximité multicellulaire, la géométrie en trois dimensions luminale, le débit et la matrice extracellulaire. Tube essais de formation en hydrogels 3D (collagène ou fibrine) 17 – 19 ou invasion des dosages 20,21 ont été utilisés pour étudier la fonction endothéliale en 3D et leurs interactions avec d' autres vasculaires 17,22 ou de cellules de tissu types 23. Cependant, assemblés lumens dans ces tests manquent interconnectivité, flux hémodynamique, et la perfusion appropriée. En outre, la tendance à la régression vasculaire dans ces tubes 24 empêche la formation des essais de culture à long terme et la maturation qui limite le degré d'études fonctionnelles qui peuvent être exécutées. Par conséquent, il est nécessaire de concevoir des plates – formes bourgeonnante in vitro des réseaux microvasculaires capable de modéliser de façon appropriée enendothéliales caractéristiques et sont capables de la culture à long terme.
Une variété de techniques d'ingénierie vasculaires ont émergé au fil des ans pour des applications médicales pour remplacer ou bypass touchés vaisseaux chez les patients atteints de maladies vasculaires. Les navires de grand diamètre fabriqués à partir de matériaux synthétiques tels que le polyéthylène téréphtalate (PET), et le polytétrafluoroéthylène (ePTFE) ont eu un succès thérapeutique considérable avec une longue perméabilité à long terme (moyenne 95% patence plus de 5 ans) 25. Bien que les greffes synthétiques de petit diamètre (<6 mm) généralement face à des complications telles que l' hyperplasie intimale et thrombopoïèse 26 – 28, ingénierie tissulaire greffes de petit diamètre réalisés avec du matériel biologique ont fait des progrès significatifs 29,30. Malgré les progrès de ce genre, les navires d'ingénierie sur le micrométrique sont restés un défi. Pour modéliser correctement le système microvasculaire, il est nécessaire de générer des configurations de réseau complexes avec sufficient résistance mécanique pour maintenir la perméabilité et avec une composition de matrice qui permet la perméation des nutriments pour les cellules parenchymateuses et le remodelage cellulaire.
Ce protocole présente une nouvelle artificielle réseau de vaisseaux perfusable qui imite un natif in vivo de réglage avec un paramètre ajustable et contrôlable microenvironnement 31-34. La méthode décrite génère microvaisseaux conçu avec des diamètres de l'ordre de 100 um. microvaisseaux d'ingénierie sont fabriqués par perfuser les cellules endothéliales à travers un canal microfluidique qui est incorporé dans le type doux collagène hydrogel. Ce système a la capacité de générer des réseaux modelées avec une structure luminale ouverte, reproduire les interactions multicellulaires, moduler la composition de la matrice extracellulaire, et appliquer des forces hémodynamiques physiologiquement pertinents.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microvaisseaux modifiés sont un modèle in vitro , où les caractéristiques physiologiques telles que la géométrie luminale, les forces hydrodynamiques et les interactions multicellulaires sont présents et accordable. Ce type de plate – forme est puissante en ce qu'elle offre la possibilité de modéliser et d' étudier le comportement de l' endothélium dans une variété de contextes où les conditions de culture in vitro dans peut être adaptée à celle du microenvironnement en que…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Lynn et Mike Garvey Laboratoire d'imagerie à l'Institut des cellules souches et médecine régénérative ainsi que la facilité de Washington nanofabrication à l'Université de Washington. Ils reconnaissent également le soutien financier de l'Institut national de la santé accorde DP2DK102258 (à YZ), et la formation accorde T32EB001650 (à SSK et MAR) et T32HL007312 (MAR).
Materials
| Wafer Fabrication | |||
| AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
| ABM Contact Aligner | AB-M | ||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
| Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
| Hot plate | VWR | 97042-646 | |
| Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
| Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
| Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
| Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| Oven | VWR | 9120976 | |
| Device Fabrication and Culture | |||
| poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
| Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
| Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
| Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
| Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
| Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bleach | Clorox | 4460030966 | |
| Petri dishes (150 X 25mm) | Corning | 430599 | |
| Petri dishes (100 X 20 mm) | Corning | 2909 | |
| Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 352097 | |
| 30 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| M199 10X Media | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1N in cell culture grade water |
| HUVECs | Lonza | ||
| Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
| 18G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 20G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
| Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
| FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
| Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2M cacodylate buffer |
| Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| Additional Culture Reagents | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
| Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
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