Micropatterning и сборка 3D микрососудов
Summary
Эта рукопись представляет собой метод литья под давлением для инженера-микрососудов, что перепросматривать физиологические свойства эндотелия. Процесс Микрожидкостных на основе создает патент 3D сети сосудов с адаптивности условиями, такими, как поток, клеточный состав, геометрии и биохимических градиентов. Процесс изготовления и примеры возможных применений описаны.
Abstract
В пробирке платформ для изучения эндотелиальные клетки и сосудистой биологии в основном ограничиваются 2D – эндотелиальной клеточной культуре, проточных камер с полимером или на основе стеклянных подложек, а также анализов образования трубки гидрогеля на основе. Эти анализы, в то время как информативным, не резюмировать люменов геометрию, правильное внеклеточный матрикс и многоклеточные близость, которые играют ключевую роль в модуляции сосудистой функции. Эта рукопись описывает метод литья под давлением для создания Engineered сосуды диаметром порядка 100 мкм. Микрососуды изготовлены затравкой эндотелиальные клетки в микрожидкостных канал встроенного в родной типа I коллагена гидрогель. Объединив паренхиматозные клетки в коллагеновой матрице предварительного направлять образование, специфические микросреды ткани могут быть смоделированы и изучены. Дополнительные модуляциями гидродинамических свойств и состава средств массовой информации позволяют управлять сложной сосудистой функции в пределах желаемого микросреды.Данная платформа позволяет для изучения набора периваскулярного клеток, крови-эндотелий взаимодействий, ответ потока и тканевой микрососудистой взаимодействий. Engineered микрососудов дают возможность изолировать влияние от отдельных компонентов сосудистой ниши и точно контролировать свои химические, механические и биологические свойства для изучения сосудистой биологии как в здоровье и болезни.
Introduction
Микрососудов в каждом органе помогает определить микросреду ткани, поддержания гомеостаза тканей и регулируют воспаление, проницаемость, тромбоз и фибринолиза 1,2. Микрососудистой эндотелий, в частности, является интерфейсом между кровотоком и окружающей ткани и , следовательно , играет критическую роль в модуляции сосудистой и функции органов в ответ на стимулы , такие как гидродинамические силы и циркулирующих цитокинов и гормонов 3 – 5. Понимание подробные взаимодействия между эндотелий, кровь, и окружающая микросреда ткани имеет важное значение для изучения сосудистой биологии и прогрессирования заболевания. Однако прогресс в изучении этих взаимодействий тормозились ограничены в пробирке инструментов , которые не Резюмируя в естественных условиях структуры микрососудов и функционируют 6,7. В результате, поле и терапевтическое продвижение уже в значительной степени опирался на дорогостоящий и Time-потребляющих животных моделей , которые часто не в состоянии перевести к успеху у людей 8 – 10. В то время как модели в естественных условиях незаменимы при изучении механизмов болезни и сосудистых функций, они являются сложными и зачастую не имеют точный контроль индивидуального клеточного, биохимических и биофизических киев.
Сосудистую систему по всему телу обладает зрелой иерархическую структуру в сочетании с экспансивной капиллярных кровати, обеспечивая оптимизированную перфузию и переноса питательных веществ одновременно 11. Первоначально сосудистую формы как примитивный сплетении , который реорганизует к иерархически разветвленной сети во время раннего развития 12,13. Хотя многие из сигналов , участвующих в этих процессах хорошо изучены 14 – 16, он остается неуловимым , как такое сосудистая структурирование определяется 15. В свою очередь, обобщал этот процесс в пробирке инженер организованных сосудистых сетей пчелп трудно. Многие из существующих платформ в пробирке для моделирования сосудистой сети , такие как двухмерных культурах эндотелиальных клеток, отсутствие важных характеристик , таких как многоклеточной близость, трехмерной геометрии просвету, потока, и внеклеточного матрикса. Анализы труб формирования в 3D гидрогелей (коллаген или фибрина) 17 – 19 или инвазии анализы 20,21 были использованы для изучения эндотелиальной функции в 3D и их взаимодействия с другими сосудистыми 17,22 или клеток ткани типов 23. Тем не менее, собранные просветы в этих анализах не хватает взаимосвязанности, гемодинамического потока и соответствующую перфузию. Кроме того, склонность к сосудистой регрессии в этих анализах образования 24 трубки предотвращает долгосрочную культуру и созреванию , которая ограничивает степень функциональных исследований , которые могут быть выполнены. Таким образом, существует необходимость в расцветающий инженер платформ в пробирке микрососудистых сетей , которые могут надлежащим образом моделировать анdothelial характеристики и способны долгосрочной культуре.
Разнообразие сосудистых инженерии появились на протяжении многих лет для медицинских применений для замены или выносной пораженных сосудов у пациентов с сосудистыми заболеваниями. Сосуды большого диаметра , изготовленные из синтетических материалов , таких как полиэтилентерефталат (ПЭТ) и политетрафторэтилена (ПТФЭ) имели значительный терапевтический успех на долгий срок ( в среднем проходимости 95% проходимость более 5 лет) 25. Несмотря на небольшой диаметр синтетических трансплантатов (<6 мм) , как правило , сталкиваются с осложнениями , такие как гиперплазии интимы и тромбопоэза 26 – 28, тканевой инженерии трансплантатов малого диаметра , изготовленные с биологическим материалом достигли значительного прогресса 29,30. Несмотря на успехи такого рода, сконструированные сосуды на микроуровне остались вызов друг другу. Для того, чтобы адекватно смоделировать микрососудов, необходимо создавать сложные сетевые модели с Sufфициент механическую прочность для поддержания проходимость и с композицией матрицы, что позволяет как питательных веществ для проникновения паренхимных клеток и клеточного ремоделирования.
Этот протокол представляет собой новую искусственную perfusable сеть сосудов , которая имитирует уроженца в естественных условиях установки с настраиваемым и управляемым микросреды 31 – 34. Описанный метод генерирует Engineered микрососуды с диаметром порядка 100 мкм. Engineered микрососудов изготавливаются перфузируя эндотелиальные клетки через микрожидком канал, который встроен в мягкого типа I коллагена гидрогель. Эта система имеет способность генерировать узорных сетей с открытой структурой просвету, тиражировать многоклеточных взаимодействий, модулировать внеклеточного матрикса состава, и применять соответствующие физиологически гемодинамические силы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Engineered микрососудов являются моделью в пробирке , где физиологические характеристики , такие как геометрия просвету, гидродинамические силы и многоклеточных взаимодействий присутствуют и перестраиваемой. Этот тип платформы является мощным в том , что она дает возможность моделир…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить Линн и Майк Гарви визуализации лаборатории в Институте стволовых клеток и регенеративной медицины, а также Вашингтон Nanofabrication фонда в Университете штата Вашингтон. Они также признают финансовую поддержку Национального института здравоохранения предоставляет DP2DK102258 (к YZ), а также обучение предоставляет T32EB001650 (к ССК и САХ) и T32HL007312 (к САХ).
Materials
| Wafer Fabrication | |||
| AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
| ABM Contact Aligner | AB-M | ||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
| Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
| Hot plate | VWR | 97042-646 | |
| Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
| Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
| Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
| Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| Oven | VWR | 9120976 | |
| Device Fabrication and Culture | |||
| poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
| Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
| Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
| Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
| Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
| Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bleach | Clorox | 4460030966 | |
| Petri dishes (150 X 25mm) | Corning | 430599 | |
| Petri dishes (100 X 20 mm) | Corning | 2909 | |
| Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 352097 | |
| 30 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| M199 10X Media | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1N in cell culture grade water |
| HUVECs | Lonza | ||
| Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
| 18G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 20G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
| Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
| FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
| Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2M cacodylate buffer |
| Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| Additional Culture Reagents | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
| Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
References
- Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, 37-44 (1993).
- van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
- Chiu, J. -. J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
- Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
- Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
- Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
- Staton, C. a., Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
- van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Leong, X. -. F., Ng, C. -. Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
- Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
- D’Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
- Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
- Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
- Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
- Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
- Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, a. R. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
- Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
- Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
- Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
- Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
- Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
- Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
- Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
- Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
- Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
- Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
- Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells – Authors’ reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
- Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
- Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
- Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
- Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
- . Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
- Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. – Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
- . Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
- Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
- Gimbrone, M. a., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
- Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
- Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).
