Micropatterning og Samling af 3D mikrokar
Summary
Dette håndskrift præsenterer en sprøjtestøbning metode til at konstruere mikrokar der rekapitule- fysiologiske egenskaber endotel. Den mikro-baseret proces skaber patent 3D vaskulære netværk med skræddersys betingelser, såsom strømning, cellulær sammensætning, form og biokemiske gradienter. Fabrikationsprocessen og eksempler på potentielle anvendelser er beskrevet.
Abstract
In vitro platforme til at studere endotelceller og vaskulære biologi er stort set begrænset til 2D endotel cellekultur, flow kamre med polymer eller glas substrater, og hydrogel-baserede rørdannelse assays. Disse analyser, mens informative, ikke rekapitulere lumen geometri, ordentlig ekstracellulære matrix, og multi-cellulære nærhed, som spiller en afgørende rolle i modulerende vaskulær funktion. Dette håndskrift beskriver en sprøjtestøbeproces metode til at generere manipuleret fartøjer med diametre i størrelsesordenen 100 um. Mikrokar er fremstillet ved podning endotelceller i en mikrofluid kanal indlejret i en nativ type I collagen hydrogel. Ved at inkorporere parenchymale celler i collagenmatrix før kanaldannelse kan specifikke væv mikromiljøer modelleres og undersøgt. Yderligere modulationer af hydrodynamisk egenskaber og medier sammensætning muliggør styring af komplekse vaskulær funktion inden for det ønskede mikromiljø.Denne platform muliggør studiet af perivaskulær celle rekruttering, blod-endotel-interaktioner, flow respons, og vævs-mikrovaskulære interaktioner. Udviklet mikrokar tilbyder muligheden for at isolere påvirkningen fra enkelte komponenter i en vaskulær niche og præcist kontrollere sine kemiske, mekaniske og biologiske egenskaber til at studere vaskulær biologi i både sundhed og sygdom.
Introduction
Mikrovaskulaturen i hvert organ til at definere vævet mikromiljø, vedligeholde vævshomeostase og regulere inflammation, permeabilitet, trombose og fibrinolyse 1,2. Mikrovaskulær endotel, især er grænsefladen mellem blodgennemstrømningen og det omgivende væv og derfor spiller en kritisk rolle i modulering vaskulære og organfunktion som reaktion på stimuli, såsom hydrodynamiske kræfter og cirkulerende cytokiner og hormoner 3 – 5. Forståelse af de detaljerede interaktioner mellem endotelet, blod og det omgivende væv mikromiljø er vigtig for studiet af vaskulær biologi og sygdomsprogression. Men fremskridt i at studere disse interaktioner er blevet hæmmet ved begrænset in vitro værktøjer, der kun gentages i vivo mikrovaskulær struktur og funktion 6,7. Som et resultat, har feltet og terapeutiske avancement var stærkt afhængig af dyre og tids-forbrugende dyremodeller, der ofte ikke oversætte til succes i mennesker 8 – 10. Mens in vivo modeller er uvurderlig i studiet af sygdomsmekanismer og vaskulære funktioner, de er komplekse og ofte mangler præcis styring af individuelle cellulære, biokemiske og biofysiske signaler.
Kar i hele kroppen besidder en moden hierarkisk struktur i forbindelse med ekspansiv kapillar senge, der giver optimal perfusion og stoftransport samtidigt 11. Oprindeligt vaskulatur former som en primitiv plexus, som reorganiserer til en hierarkisk forgrenet netværk under tidlig udvikling 12,13. Selv om mange af de involverede i disse processer signaler godt forstået 14-16, er det stadig undvigende, hvordan en sådan vaskulær mønster bestemmes 15. Til gengæld den gentog denne proces in vitro til ingeniør organiserede vaskulære netværk har bin vanskelige. Mange eksisterende in vitro platforme til at modellere vaskulatur, såsom todimensionale endotheliale cellekulturer, mangler vigtige egenskaber såsom multi-cellulære nærhed, tredimensionelle luminal geometri, flow, og ekstracellulære matrix. Tube dannelse analyser i 3D hydrogeler (kollagen eller fibrin) 17 – 19 eller invasion assays 20,21 er blevet brugt til at studere endotel funktion i 3D og deres samspil med andre vaskulære 17,22 eller væv celletyper 23. Men samlet lumen i disse analyser mangler sammenkobling, hæmodynamisk flow, og passende perfusion. Endvidere tilbøjeligheden for vaskulær regression i disse kanaldannelse assays 24 forhindrer langtidsdyrkning og modning hvilket begrænser graden af funktionelle undersøgelser, der kan udføres. Således er der et spirende behov for at konstruere in vitro platforme af mikrovaskulære netværk, der passende kan modellere dadothelial egenskaber og er i stand til langtidsdyrkning.
En række af vaskulære teknikker er opstået i årenes løb til medicinske anvendelser til at erstatte eller bypass påvirket fartøjer i patienter med vaskulær sygdom. Stor diameter fartøjer fremstillet af syntetiske materialer, såsom polyethylenterephthalat (PET), og polytetrafluorethylen (ePTFE) har haft en betydelig terapeutisk succes med langsigtede åbenhed (gennemsnit 95% åbenhed over 5 år) 25. Selv om små diameter syntetiske transplantater (<6 mm) typisk står komplikationer såsom intimahyperplasi og trombopoiese 26 – 28, manipuleret væv lille diameter transplantater lavet med biologisk materiale har gjort betydelige fremskridt 29,30. Trods fremskridt af denne art, har manipuleret fartøjer på mikroskala forblevet en udfordring. For på tilfredsstillende vis at modellere mikrovaskulaturen, er det nødvendigt at generere komplekse netværk mønstre med til-strækkelig mekanisk styrke til at opretholde åbenheden og med en matrix sammensætning, som giver mulighed for både næringsstoffer permeation for parenchymale celler og cellulær remodeling.
Denne protokol udgør en roman kunstigt perfusable fartøj netværk, der efterligner en indfødt in vivo omgivelser med en justerbar og kontrollerbar mikromiljø 31-34. Den beskrevne metode genererer manipuleret mikrokar med diametre i størrelsesordenen 100 um. Manipulerede mikrokar er fremstillet ved perfusion endotelceller via en mikrofluid kanal, der er indlejret i blød type I collagen hydrogel. Dette system har kapacitet til at generere mønstrede netværk med åben luminal struktur, replikere multi-cellulære interaktioner, modulere ekstracellulær matrix sammensætning, og anvende fysiologisk relevante hæmodynamiske kræfter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Manipulerede mikrokar er en in vitro model, hvor fysiologiske karakteristika såsom luminal geometri, hydrodynamiske kræfter, og multi-cellulære interaktioner er til stede og afstemmelige. Denne type platform er stærk, idet den giver mulighed for at modellere og studere endothelial adfærd i mange forskellige sammenhænge, hvor in vitro-dyrkningsbetingelser kan matches til den for mikromiljøet pågældende. For eksempel de mekanismer køre endoteliale processer, såsom angiogenese, vides at f…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Lynn og Mike Garvey Imaging Laboratory ved Institut for Stamcelleforskning og regenerativ medicin samt Washington nanofabrikation Facility på University of Washington. De erkender også økonomisk støtte fra National Institute of Health giver DP2DK102258 (til YZ), og uddannelse giver T32EB001650 (til SSK og MAR) og T32HL007312 (til MAR).
Materials
| Wafer Fabrication | |||
| AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
| ABM Contact Aligner | AB-M | ||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
| Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
| Hot plate | VWR | 97042-646 | |
| Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
| Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
| Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
| Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| Oven | VWR | 9120976 | |
| Device Fabrication and Culture | |||
| poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
| Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
| Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
| Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
| Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
| Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bleach | Clorox | 4460030966 | |
| Petri dishes (150 X 25mm) | Corning | 430599 | |
| Petri dishes (100 X 20 mm) | Corning | 2909 | |
| Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 352097 | |
| 30 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| M199 10X Media | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1N in cell culture grade water |
| HUVECs | Lonza | ||
| Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
| 18G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 20G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
| Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
| FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
| Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2M cacodylate buffer |
| Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| Additional Culture Reagents | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
| Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
References
- Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, 37-44 (1993).
- van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
- Chiu, J. -. J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
- Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
- Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
- Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
- Staton, C. a., Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
- van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Leong, X. -. F., Ng, C. -. Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
- Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
- D’Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
- Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
- Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
- Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
- Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
- Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, a. R. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
- Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
- Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
- Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
- Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
- Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
- Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
- Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
- Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
- Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
- Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
- Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells – Authors’ reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
- Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
- Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
- Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
- Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
- . Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
- Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. – Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
- . Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
- Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
- Gimbrone, M. a., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
- Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
- Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).
