Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader
Summary
Dieses Manuskript stellt ein Spritzgussverfahren microvessels zu entwickeln, die physiologischen Eigenschaften des Endothels rekapitulieren. Die Mikrofluidik-basierten Prozess erstellt Patent 3D Gefäßnetze mit tailor Bedingungen, wie Durchfluss, zelluläre Zusammensetzung, Geometrie und biochemische Steigungen. Das Herstellungsverfahren und Beispiele für mögliche Anwendungen beschrieben.
Abstract
In – vitro – Plattformen Endothelzellen und Gefäßbiologie zu studieren , um 2D – endothelialen Zellkultur, Strömungskammern mit Polymer oder Glas basierenden Substraten und Hydrogel-basierte Rohrbildungstests weitgehend begrenzt sind. Diese Tests, während informativ, nicht rekapitulieren nicht Lumen Geometrie, richtige extrazellulären Matrix und mehrzelligen Nähe, die bei der Modulation der Gefäßfunktion eine Schlüsselrolle spielen. Dieses Manuskript beschreibt ein Spritzgussverfahren Engineered Gefäße mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 100 & mgr; m zu erzeugen. Microvessels werden durch Impfen Endothelzellen in einem mikrofluidischen Kanal innerhalb einer nativen Typ-I-Kollagen-Hydrogel eingebettet hergestellt. Durch die Integration von Bildung Parenchymzellen in der Kollagenmatrix vor dem Kanal können spezifische Gewebe-Mikroumgebungen modelliert und untersucht werden. Zusätzliche Modulationen der hydrodynamischen Eigenschaften und Medienzusammensetzung ermöglichen Steuerung von komplexen Gefäßfunktion innerhalb des gewünschten Mikro.Diese Plattform ermöglicht die Studie von perivaskulären Zellrekrutierung, Blut-Endothel-Interaktionen, Flussantwort und Gewebe-mikrovaskulären Wechselwirkungen. Ausgeführt microvessels bieten die Möglichkeit, den Einfluss von einzelnen Komponenten eines vaskulären Nische zu isolieren und zu steuern, genau seine chemischen, mechanischen und biologischen Eigenschaften der Gefäßbiologie sowohl in Gesundheit und Krankheit zu studieren.
Introduction
Die Mikrovaskulatur in jedem Organ hilft , die Gewebemikroumgebung definieren, Gewebe – Homöostase und Entzündung regulieren, Permeabilität, Thrombose und Fibrinolyse 1,2 aufrechtzuerhalten. Mikrovaskulären Endothel, insbesondere ist die Schnittstelle zwischen der Blutströmung und dem umgebenden Gewebe und somit eine kritische Rolle spielt Gefäß- und Organfunktion in Reaktion auf Reize wie hydrodynamischen Kräfte in Modulieren und zirkulierende Cytokine und Hormone 3 bis 5. Das Verständnis der detaillierten Wechselwirkungen zwischen dem Endothel, Blut, und das umgebende Gewebe Mikroumgebung ist für die Untersuchung der Gefäßbiologie und Fortschreiten der Krankheit wichtig. Allerdings sind die Fortschritte , diese Interaktionen in das Studium wurde durch de – vitro – Tools beschränkt behindert , die in vivo mikrovaskulären Struktur rekapitulieren nicht und Funktion 6,7. Als Ergebnis hat sich das Feld und therapeutischen Fortschritt stark auf kostspielige und zeit verlassenraubend Tiermodelle , die oft nicht zum Erfolg beim Menschen 8 zu übersetzen – 10. Während in vivo – Modellen bei der Untersuchung von Krankheitsmechanismen und vaskuläre Funktionen sind von unschätzbarem Wert, sind sie komplex und fehlt oft eine genaue Kontrolle der einzelnen zellulären, biochemischen und biophysikalischen Signale.
Gefäßsystem im ganzen Körper verfügt über eine breite hierarchische Struktur in Verbindung mit expansive kapillaren Betten, optimierte Perfusion und Nährstofftransport gleichzeitig 11 bereitstellt. Zunächst Gefäßformen als primitive Plexus , die 12,13 während der frühen Entwicklung zu einem hierarchisch verzweigten Netzwerk reorganisiert. Obwohl viele der in diesen Prozessen beteiligt sind Signale gut 14 verstanden werden – 16, bleibt es schwer , wie solche Gefäßmuster 15 bestimmt wird. Im Gegenzug diesen Prozess in vitro zu rekapitulieren organisierten Gefäßnetze zu konstruieren hat Bienen schwierig. Viele existierende in vitro Plattformen Vaskulatur, wie zweidimensionale Endothelzellkulturen zu modellieren, fehlen wichtige Eigenschaften wie mehrzelligen Nähe dreidimensionale luminalen Geometrie, Durchfluss- und extrazellulären Matrix. Rohrbildungstests in 3D Hydrogele (Collagen oder Fibrin) 17-19 oder Invasionsassays 20,21 verwendet wurden 23 Endothelfunktion in 3D und ihre Wechselwirkungen mit anderen vaskulären 17,22 oder Gewebezelltypen zu untersuchen. Allerdings montiert Lumen in diesen Tests fehlt Verbunds, der hämodynamischen Strömungs und entsprechende Perfusion. Darüber hinaus verhindert die Neigung zur Gefäß Regression in diesen Rohrbildungstests 24 Langzeitkultur und Reifung , die den Grad der funktionellen Studien begrenzt, die durchgeführt werden können. Somit gibt es einen wachsenden Bedarf in vitro Plattformen der mikrovaskulären Netzwerke zu konstruieren , die in geeigneter Weise modellieren endothelial Eigenschaften und sind in der Lage Langzeitkultur.
Eine Vielzahl von vaskulären Engineering-Techniken haben in den letzten Jahren für medizinische Anwendungen entstanden bei Patienten mit Gefäßerkrankung zu ersetzen oder zu umgehen betroffenen Schiffe. Mit großem Durchmesser Gefäße aus synthetischen Materialien, wie Polyethylenterephthalat (PET), und Polytetrafluorethylen (ePTFE) , haben erhebliche therapeutische Erfolge mit Langzeitdurchgängigkeit (durchschnittlich 95% Durchgängigkeit über 5 Jahre) 25 hatte. Obwohl mit kleinem Durchmesser synthetische Transplantate (<6 mm) in der Regel Komplikationen konfrontiert wie Intimahyperplasie und Thrombopoese 26 – 28, Gewebe mit kleinem Durchmesser Transplantate mit biologischen Material entwickelt haben erhebliche Fortschritte gemacht 29,30. Trotz Fortschritten dieser Art entwickelt, Schiffe, die auf der Mikroskala haben eine Herausforderung geblieben. Um adäquat microvasculature zu modellieren, ist es notwendig, komplexe Netzwerkstrukturen mit suf zu erzeugenreichend mechanische Festigkeit Durchgängigkeit und mit einer Matrix-Zusammensetzung zu erhalten, die für die parenchymalen Zellen und Zellumbau für beide Nahrungsmittelpermeation ermöglicht.
Dieses Protokoll stellt einen neuartigen künstlichen perfundierbaren Gefäßnetz , das eine native in vivo nachahmt mit einem abstimmbaren und steuerbaren Mikroumgebung schaffen 31-34. Das beschriebene Verfahren erzeugt Engineered microvessels mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 100 & mgr; m. Ausgeführt microvessels werden hergestellt durch Perfusion Endothelzellen durch einen mikrofluidischen Kanal, der in weichen Typ eingebettet ist I-Hydrogel-Kollagen. Dieses System hat die Fähigkeit, gemusterten Netzwerke mit offenen Struktur luminalen erzeugen, replizieren multi-zellulären Interaktionen modulieren extrazellulären Matrixzusammensetzung und gelten physiologisch relevanten hämodynamischen Kräften.
Protocol
Representative Results
Discussion
Engineered microvessels sind ein in vitro – Modell , wo physiologische Eigenschaften wie luminalen Geometrie, hydrodynamischen Kräfte und mehrzelligen Wechselwirkungen vorhanden und abstimmbaren sind. Diese Art von Plattform ist in leistungsstark , dass es bietet die Möglichkeit , endothelial Verhalten in einer Vielzahl von Kontexten zu modellieren und zu studieren , wo die in vitro Kulturbedingungen können zu der der Mikroumgebung in Frage abgestimmt werden. Zum Beispiel werden die Antriebsmechanis…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Lynn und Mike Garvey Imaging Labor am Institut für Stammzell und Regenerative Medizin, sowie die Washington Nanofabrication Einrichtung an der Universität von Washington zu bestätigen. Sie erkennen auch die finanzielle Unterstützung des National Institute of Health gewährt DP2DK102258 (zu YZ) und die Ausbildung gewährt T32EB001650 (bis SSK und MAR) und T32HL007312 (MAR).
Materials
| Wafer Fabrication | |||
| AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
| ABM Contact Aligner | AB-M | ||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
| Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
| Hot plate | VWR | 97042-646 | |
| Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
| Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
| Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
| Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| Oven | VWR | 9120976 | |
| Device Fabrication and Culture | |||
| poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
| Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
| Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
| Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
| Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
| Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bleach | Clorox | 4460030966 | |
| Petri dishes (150 X 25mm) | Corning | 430599 | |
| Petri dishes (100 X 20 mm) | Corning | 2909 | |
| Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 352097 | |
| 30 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| M199 10X Media | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1N in cell culture grade water |
| HUVECs | Lonza | ||
| Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
| 18G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 20G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
| Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
| FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
| Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2M cacodylate buffer |
| Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| Additional Culture Reagents | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
| Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
References
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