Summary

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

Published: September 09, 2016
doi:

Summary

כתב יד זה מציג שיטת הזרקה להנדס microvessels כי לשחזר מאפיינים פיסיולוגיים של האנדותל. תהליך microfluidic המבוסס יוצר רשתות כלי דם 3D פטנט עם תנאי tailorable, כגון זרימה, רכב הסלולר, גיאומטריה, והדרגות ביוכימיים. תהליך ייצור ודוגמאות של יישומים פוטנציאליים מתוארים.

Abstract

בשנת פלטפורמות במבחנה ללמוד בתאי האנדותל וביולוגיה וסקולרית מוגבלים במידה רבה לתרבות תא האנדותל 2D, לזרום תאים עם פולימר או מצעים מלוחים וזכוכית, מבחני היווצרות צינור מבוסס הידרוג'ל. מבחנים אלו, תוך אינפורמטיבי, לא לשחזר גיאומטרית לומן, מטריקס ראויה, קרבה רבה תאית, אשר ממלאת תפקידים מרכזיים ויסות תפקוד כלי דם. כתב יד זה מתאר שיטת הזרקה לייצר כלי Engineered בקטרים ​​בסדר גודל של 100 מיקרומטר. Microvessels מיוצרים על ידי זריעת לתאי אנדותל ערוץ microfluidic מוטבע בתוך סוג יליד שאני קולגן הידרוג'ל. על ידי שילוב תאי parenchymal בתוך המטריצה ​​קולגן לפני לתעל היווצרות, microenvironments רקמות הספציפי יכול להיות מודל ולומד. מודולציות נוסף של הרכב נכסים ומדיה הידרודינמית לאפשר בקרה של תפקוד כלי הדם מורכב במיקרו-סביבה של הרצוי.פלטפורמה זו מאפשרת לחקר גיוס תא perivascular, אינטראקציות האנדותל דם, תגובת זרימה, ואינטראקציות-כלי דם לרקמות. microvessels המהונדס מציע את היכולת לבודד את השפעת מרכיבים בודדים של נישת כלי דם ולשלוט הכימיים שלה בדיוק, מכאניות, ואת תכונות ביולוגיות ללמוד ביולוגיה וסקולרית בשתי בריאות ומחלות.

Introduction

על נימי הדם הזעירים בכל איבר עוזר להגדיר את microenvironment רקמות, לשמור על הומאוסטזיס רקמות לווסת דלקת, חדירות, פקקת, ו פירוק פיברין 1,2. האנדותל כלי הדם, בפרט, הוא ממשק בין זרימת הדם ואת הרקמה שמסביב ועל כן היא משחקת תפקיד קריטי בויסות וסקולרית ותפקוד איברים בתגובה לגירויים כגון כוחות הידרודינמית במחזור ציטוקינים והורמונים 3 5. הבנת יחסי הגומלין המפורט בין האנדותל, הדם, ואת המיקרו-סביבת הרקמה הסובבת חשובה לחקר ביולוגיה של כלי דם ואת התקדמות מחלה. עם זאת, התקדמות בחקר אינטראקציות אלה התעכבה בשל מוגבלות כלים במבחנה שאינו לשחזר במבנה כלי דם vivo ולתפקד 6,7. כתוצאה מכך, השדה והקידום טיפולי הסתמכו בכבדות על יקר הזמן-רב במודלים של בעלי חיים כי לעיתים קרובות אינם מצליחים לתרגם להצלחה בבני אדם 8 10. בעוד מודלים in vivo הם לא יסולא בפז בחקר מנגנוני המחלה ופונקציות וסקולרית, הם מורכבים ולעיתים קרובות חסרי שליטה מדויקת של הסלולר, ביוכימיים הפרט, רמזים biophysical.

כלי דם בכל הגוף הוא בעל מבנה היררכי בוגר בשיתוף עם מיטות נימי מרחיבה, מתן זלוף אופטימיזציה תחבורה מזין 11 בו זמנית. בתחילה, טפסים בכלי דם כמו מקלעת פרימיטיבית אשר מארגנת מחדש לרשת מסועפת באופן היררכי במהלך ההתפתחות מוקדמת 12,13. למרות שרבים מן האותות מעורבים בתהליכים אלה מובנים היטב 14 16, הוא נשאר חמקמק איך כגון דפוסים של כלי דם נקבעו 15. בתורו, משחזר את התהליך הזה במבחנה להנדס רשתות כלי דם מאורגנות יש דבוריםn קשה. פלטפורמות רבות הקיימות במבחנת מודל בכלי דם, כגון שתי תרבויות תא האנדותל ממדיות, חסרות מאפיינים חשובים כגון קרבה רבה תאית, שלוש גיאומטריה לומינל ממדי, זרימה, ואת מטריקס. מבחני היווצרות צינור ב הידרוג 3D (קולגן או הפיברין) 17 19 או הפלישה מבחני 20,21 שימשו ללמוד את תפקוד האנדותל ב -3 D ויחסי הגומלין שלהם עם 17,22 או תא רקמה וסקולרית אחרים סוגי 23. עם זאת, התאסף לומן מבחנים אלה חסרים גומלין, זרימת המודינמי, ו זלוף המתאים. יתר על כן, הנטייה לרגרסיה וסקולרית מבחני היווצרות צינור אלה 24 מונעת תרבות לטווח ארוכה והתבגרות המגבילה את מידת מחקרים פונקציונליים שניתן לבצע. לפיכך, יש צורך המתפתח להנדס במבחנת פלטפורמות של רשתות כלי דם שיכול מודל כראוי endothelial מאפיינים ומסוגלים התרבות לטווח ארוך.

מגוון של טכניקות הנדסה וסקולרית צמח במשך השנים ליישומים רפואיים להחליף או כלי מושפע מעקפים בחולים עם מחלת כלי דם. כלי בקוטר גדול מחומרים סינתטיים כגון terephthalate פוליאתילן (PET), ו polytetrafluoroethylene (ePTFE) נחלו הצלחה טיפולית ניכר עם patency לטווח ארוך (patency 95% בממוצע על פני 5 שנים) 25. למרות שתלי סינתטי קטן בקוטר (<6 מ"מ) בדרך כלל להתמודד עם סיבוכים כגון היפרפלזיה intimal ואת thrombopoiesis 26 28, רקמות מהונדסות שתלי בקוטר קטן עשה עם חומר ביולוגי יש התקדמות משמעותית 29,30. למרות התקדמות מסוג זה, כלי מהונדסים על microscale נותרו אתגר. כדי לעצב את microvasculature כראוי, יש צורך ליצור דפוסי רשת מורכבים עם הסוףחוזק מכני ficient כדי לשמור patency ועם רכב מטריקס המאפשר כאחד חלחול מזין עבור תאי parenchymal שיפוץ הסלולר.

פרוטוקול זה מציג רשת כלי perfusable מלאכותית רומן מחקה יליד in vivo הגדרה עם microenvironment מתכונן לשליטה 31 34. השיטה המתוארת יוצרת microvessels Engineered בקטרים ​​בסדר גודל של 100 מיקרומטר. microvessels המהונדס מיוצר על ידי מרוסס תאי אנדותל דרך ערוץ microfluidic שמוטבע בתוך הסוג רך אני קולגן הידרוג'ל. מערכת זו יש את היכולת ליצור רשתות בדוגמת עם מבנה לומינל פתוח, לשכפל אינטראקציות רבות תאיות, לווסת רכב תאי מטריקס, ולהחיל כוחות המודינמי רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.

Protocol

Microfabrication 1. Patterned polydimethylsiloxane (PDMS) עם רשת עיצוב ייצור פרוסות סיליקון כדי ליצור תבנית שלילית של עיצוב הרשת צור דפוס רשת באמצעות כל תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD). ודא כ…

Representative Results

פלטפורמת הכלים המהונדסת יוצרת microvasculature הפונקציונלי מוטבע בתוך סוג קולגן טבעי שאני מטריקס ומאפשרת שליטה צפופה של הקהילה הסלולר, biophysical ו ביוכימיים במבחנה. כדי לפברק microvessels מהונדסים, תאי אנדותל וריד אדם הטבור (HUVECs) הם perfused דרך הרשת microfluidic-מוטבע ק…

Discussion

Microvessels המהונדס מהווה מודל במבחנה שבה מאפיינים פיסיולוגיים כגון גיאומטריה לומינל, כוחות הידרודינמית, ואינטראקציות רבות תאיות קיימים מתכונן. סוג של פלטפורמה זו היא בעלת עוצמה בכך שהיא מציעה את היכולת לבנות מודל ללמוד את ההתנהגות אנדותל במגוון הקשרים בהם התנאים ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לין ומייק גארווי הדמיה מעבדה במכון תאי גזע ורפואה רגנרטיבית וכן מתקן Nanofabrication וושינגטון באוניברסיטת וושינגטון. הם גם מכירים את התמיכה הכספית של המכון הלאומי לבריאות מעניקה DP2DK102258 (כדי YZ), והכשרה מעניקה T32EB001650 (כדי SSK ו MAR) ו T32HL007312 (כדי MAR).

Materials

Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma System AutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc  PWM32 Spin Coater 
ABM Contact Aligner AB-M
Alpha Step Profilometer Tencor Alpha Step 200
SU-8 Developer Microchem Y020100
SU-8 Resist Microchem SU-8 2000
8" silicon wafer Wafer World Inc.
Tabletop Micro Pattern Generator Heidelberg Instruments μPG 101 For generation of photomask
Hot plate VWR 97042-646
Ispropyl alcohol Avantor Performance Materials 9088
Petri dishes (120 x 120 mm, square) Sigma-Aldrich Z617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane Sigma-Aldrich MKBG3805V
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent Dow Corning Sylgard 184 Mixed at 10:1 (w/w)
Vacuum desiccator Sigma-Aldrich Z119024-1EA
Oven VWR 9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA) Plexiglas
Corona Treater Electro-Technic Products, Inc. BD-20 Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds
Soldering Iron Weller  WTCPS
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw McMaster-Carr  91785A096
Stainless steel dowel pins McMaster-Carr  93600A060
Tweezers  Miltex 24-572 Any similar tweezers may be used
Spatula (Micro Spoon) Electron Microscopy Services 62410-01
Screw driver Any flat head screwdriver may be used, autoclaved
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542B
Bleach Clorox 4460030966
Petri dishes (150 X 25mm) Corning 430599
Petri dishes (100 X 20 mm) Corning 2909
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces Autoclaved
Polyethyleneimine (PEI) Sigma-Aldrich P3143 Dilute to 1% in cell culture grade water
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G6257 Dilute to 0.1% in cell culture grade water
Sterile H2O Autoclaved DI H2O
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 mL syringe BD 309659
10 mL syringe BD 309604
15 mL conical tubes Corning 352097
30 mL conical tubes Corning 352098
M199 10X Media  Life Technologies 11825-015
1N NaOH (sterile) Sigma-Aldrich 415413 Dilute to 1N in cell culture grade water
HUVECs  Lonza
Endothelial growth media Lonza CC-3124
Trypsin Corning 25-052-CI
Fetal bovine serum (FBS) Thermofisher Scientific 10082147
Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) Sigma-Aldrich 31390
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-031-CV
Hemocytometer Hausser Scientific Co. 3200
Gel loading tips VWR 37001-152
18G Blunt Fill Needle BD  305180
20G Stainless Steel Dispensing Needle McMaster-Carr 75165A123
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing Cole-Parmer EW-95702-00
1/16" Tube-to-tube Coupling McMaster-Carr 5116K165
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube McMaster-Carr 5121K901
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) McMaster-Carr 51525K211
Plastic Forceps, with Jaw Grips Electron Microscopy Services 72971
Dual Syringe Pump Harvard Apparatus 70-4505
5 mL Polystyrene Round-bottom tube Fisher Scientific 14-959-2A
Device Analysis
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A8806-5G
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Rabbit anti-hCD31 Abcam ab32457 1:25 working dilution
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody Abcam ab8822 1:100 working dilution
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody Thermofisher Scientific A-11011 1:100 working dilution
Hoescht Thermofisher Scientific H1399 Resuspended in DMSO
Sodium cacodylate  Sigma-Aldrich C0250 To make 0.2M cacodylate buffer
Ethanol VWR International BDH1164-4LP
40kDa FITC-conjugated Dextran Sigma-Aldrich FD40S 
Additional Culture Reagents 
CHIR-99021 Selleck Chem S2924 Small molecule GSK-3 inhibitor
Human recombinant VEGF Peprotech 100-20
Human recombinant bFGF Peprotech AF-100-18B

References

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -. J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a., Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
  10. Leong, X. -. F., Ng, C. -. Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757 (2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D’Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, a. R. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells – Authors’ reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858 (2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  36. . Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. – Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
  40. . Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2 (2009).
check_url/fr/54457?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Roberts, M. A., Kotha, S. S., Phong, K. T., Zheng, Y. Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels. J. Vis. Exp. (115), e54457, doi:10.3791/54457 (2016).

View Video