Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D
Summary
Este manuscrito presenta un método de moldeo por inyección para diseñar microvasos que recapitular las propiedades fisiológicas de endotelio. El proceso basado en microfluidos crea redes vasculares 3D patente con condiciones tailorable, tales como gradientes bioquímicos de flujo, composición celular, la geometría, y. Se describe el proceso de fabricación y los ejemplos de posibles aplicaciones.
Abstract
En plataformas in vitro para estudiar las células endoteliales y la biología vascular se limitan en gran medida a la cultura de células endoteliales 2D, el flujo cámaras con polímero o sustratos a base de vidrio, y ensayos de formación de tubo a base de hidrogel. Estos ensayos, mientras informativa, no se recapitulan la geometría del lumen, la matriz extracelular adecuada, y la proximidad multicelular, que juegan un papel clave en la modulación de la función vascular. Este manuscrito describe un método de moldeo por inyección para generar vasos diseñado con diámetros del orden de 100 micras. Los microvasos se fabrican mediante la siembra de células endoteliales en un canal microfluídico incrustado dentro de un tipo nativo I colágeno hidrogel. Mediante la incorporación de las células del parénquima dentro de la matriz de colágeno antes de la formación de canal, microambientes específicos de tejido pueden ser modeladas y estudiadas. modulaciones adicionales de propiedades y medios hidrodinámico composición permiten el control de la función vascular compleja dentro del microambiente deseada.Esta plataforma permite el estudio de la contratación perivascular de células, las interacciones sangre-endotelio, respuesta de flujo, y las interacciones de tejido microvascular. microvasos ingeniería ofrecen la posibilidad de aislar la influencia de los componentes individuales de un nicho vascular y precisamente controlan sus químicos, biológicos, mecánicos y propiedades para estudiar la biología vascular tanto en la salud y la enfermedad.
Introduction
La microvasculatura en cada órgano ayuda a definir el microambiente del tejido, mantener la homeostasis del tejido y regulan la inflamación, la permeabilidad, la trombosis, y la fibrinólisis 1,2. Endotelio microvascular, en particular, es la interfaz entre el flujo sanguíneo y el tejido circundante y por lo tanto juega un papel crítico en la modulación de la función del órgano vascular y en respuesta a estímulos tales como las fuerzas hidrodinámicas y citoquinas circulantes y hormonas 3 – 5. La comprensión de las interacciones detalladas entre el endotelio, la sangre y el microambiente tejido circundante es importante para el estudio de la biología vascular y progresión de la enfermedad. Sin embargo, los avances en el estudio de estas interacciones se ha visto obstaculizado por limitada en herramientas in vitro que no recapitulan en la estructura microvascular vivo y la función 6,7. Como resultado, el campo y el avance terapéutico se ha basado en gran medida en costoso y tiempo-el consumo de modelos animales que a menudo no traducir del éxito en seres humanos 8 – 10. Mientras que los modelos in vivo son de gran valor en el estudio de mecanismos de la enfermedad y funciones vasculares, que son complejas y a menudo carecen de un control preciso del individuo celular, bioquímica, y las señales biofísicas.
Vasculatura en todo el cuerpo posee una estructura jerárquica madura en conjunción con lechos capilares expansivas, proporcionando la perfusión optimizado y el transporte de nutrientes al mismo tiempo 11. Inicialmente, las formas vasculatura como un plexo primitiva que reorganiza a una red jerárquica ramificada durante el desarrollo temprano 12,13. Aunque muchas de las señales implicadas en estos procesos se conocen bien 14 – 16, sigue siendo difícil de alcanzar, tales cómo el patrón vascular se determina 15. A su vez, la recapitulación de este proceso in vitro para diseñar redes vasculares organizados tiene abejan. Muchas plataformas difíciles existentes in vitro para modelar la vasculatura, por ejemplo, dos cultivos de células endoteliales dimensionales, carecen de características importantes tales como la proximidad multi-celular, tres geometría luminal dimensional, flujo, y de la matriz extracelular. Los ensayos de formación de tubos en 3D (hidrogeles de colágeno o fibrina) 17 – 19 o invasión ensayos de 20,21 se han utilizado para estudiar la función endotelial en 3D y sus interacciones con otras vasculares 17,22 celulares o tejidos tipos 23. Sin embargo, ensamblados lúmenes en estos ensayos carecen de interconectividad, el flujo hemodinámico, y la perfusión adecuada. Además, la propensión a la regresión vascular en estos ensayos de formación de tubo 24 impide que la cultura a largo plazo y la maduración que limita el grado de estudios funcionales que se pueden realizar. Por lo tanto, hay una necesidad creciente para diseñar plataformas in vitro de redes microvasculares que pueden modelar adecuadamente ESendotelial características y son capaces de cultivo a largo plazo.
Una variedad de técnicas de ingeniería vasculares han surgido en los últimos años para aplicaciones médicas para reemplazar o vasos de derivación afectada en pacientes con enfermedad vascular. Vasos de gran diámetro fabricados con materiales sintéticos tales como tereftalato de polietileno (PET), y politetrafluoroetileno (PTFE) han tenido un considerable éxito terapéutico con la permeabilidad a largo plazo (promedio 95% la permeabilidad de más de 5 años) 25. Aunque de pequeño diámetro injertos sintéticos (<6 mm) por lo general se enfrentan a complicaciones tales como hiperplasia de la íntima y trombopoyesis 26 – 28, ingeniería tisular injertos de pequeño diámetro hechos con material biológico han hecho progresos significativos 29,30. A pesar de los avances de este tipo, los vasos de ingeniería en la microescala han seguido siendo un reto. Para modelar adecuadamente la microvasculatura, es necesario para generar patrones de red complejas con sufciente resistencia mecánica para mantener la permeabilidad y con una composición de matriz que permite tanto la permeación de nutrientes para las células del parénquima y remodelación celular.
Este protocolo presenta una novedosa red de vasos artificiales perfusable que imita un nativo in vivo con un ajuste ajustable y controlable microambiente el 31 de – de 34. El método descrito genera microvasos Diseñado con diámetros del orden de 100 micras. microvasos ingeniería se fabrican mediante la perfusión de las células endoteliales a través de un canal de microfluidos que está incrustado dentro del tipo I colágeno suave hidrogel. Este sistema tiene la capacidad de generar redes modelados con estructura luminal abierta, replicar las interacciones multicelulares, modular la composición de la matriz extracelular, y aplicar fuerzas hemodinámicas fisiológicamente relevantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microvasos de ingeniería son un modelo in vitro, donde están presentes y sintonizable características fisiológicas, tales como la geometría luminal, las fuerzas hidrodinámicas, y las interacciones multicelulares. Este tipo de plataforma es de gran alcance, ya que ofrece la posibilidad de modelar y estudiar el comportamiento del endotelio en una variedad de contextos en los que las condiciones de cultivo in vitro en puede ser igualada a la del microambiente en cuestión. Por ejemplo, los mecanismo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer la Lynn y Mike Garvey Laboratorio de Imagen en el Instituto de Células Madre y Medicina Regenerativa, así como el Fondo de Washington nanofabricación de la Universidad de Washington. También reconocen el apoyo financiero del Instituto Nacional de Salud otorga DP2DK102258 (a YZ), y la formación otorga T32EB001650 (a SSK y MAR) y T32HL007312 (MAR).
Materials
| Wafer Fabrication | |||
| AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
| ABM Contact Aligner | AB-M | ||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
| Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
| Hot plate | VWR | 97042-646 | |
| Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
| Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
| Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
| Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| Oven | VWR | 9120976 | |
| Device Fabrication and Culture | |||
| poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
| Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
| Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
| Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
| Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
| Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
| Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Bleach | Clorox | 4460030966 | |
| Petri dishes (150 X 25mm) | Corning | 430599 | |
| Petri dishes (100 X 20 mm) | Corning | 2909 | |
| Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
| Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 352097 | |
| 30 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| M199 10X Media | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1N in cell culture grade water |
| HUVECs | Lonza | ||
| Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
| 18G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
| 20G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
| Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
| Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| Device Analysis | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
| FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
| Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2M cacodylate buffer |
| Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
| Additional Culture Reagents | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
| Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
References
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