Bu el yazması endotele fizyolojik özelliklerini recapitulate mikrodamarlar mühendisi bir enjeksiyon kalıplama yöntemi sunar. Mikroakışkan tabanlı süreç böyle akışı, hücresel kompozisyon, geometri ve biyokimyasal geçişlerini olarak Uyarlanabilen koşullar, patent 3D damar ağları oluşturur. üretim süreci ve potansiyel uygulama örnekleri açıklanmıştır.
Nitro platformlarda, endotel hücreleri, vasküler biyolojisi ölçüde 2B endotelyal hücre kültürü ile sınırlıdır çalışma polimer veya cam bazlı substratlar ve hidrojel-bazlı tüp oluşumu testleri ile odaları akar. Bu testlerin, bilgilendirici olurken, vasküler fonksiyonun düzenlenmesinde önemli rol oynarlar lümen geometri, uygun hücre dışı matriks ve çok hücreli yakınlığı, recapitulate yok. Bu yazıda 100 um mertebesinde çapları ile mühendislik damarları üretmek için bir enjeksiyon kalıplama yöntemi tarif etmektedir. Mikrodamarlar Ben hidrojel kollajen yerel türü içinde gömülü bir mikroakışkan kanal endotel hücrelerin ekim tarafından üretilmektedir. oluşumu kanal önce kollajen matris içinde parankimal hücreler dahil olarak, belirli bir doku microenvironments modellenmiştir incelenebilir. hidrodinamik özellikleri ve medya kompozisyon ek modülasyon istenen mikroçevresinin içinde karmaşık vasküler fonksiyon kontrolü için izin verir.Bu platform, perivasküler hücre alımı, kan endotel etkileşimlerini akış cevap ve doku-mikrovasküler etkileşimleri çalışma sağlar. Engineered mikrodamarlar bir damar niş bireysel bileşenlerinden etkisini izole etmek olanağı sunmak ve hassas sağlık ve hastalık hem de vasküler biyoloji okumak için kimyasal, mekanik ve biyolojik özelliklerini kontrol eder.
Her organ mikrovasküler, doku mikro tanımlamak doku homeostazını korumak ve inflamasyon, geçirgenlik, tromboz ve fibrinoliz 1,2 düzenlenmesine yardımcı olur. 5 – mikrovasküler endotel, özellikle, bu nedenle, kan akışı ve çevreleyen doku arasında bir arayüz, hidrodinamik kuvvetler ve dolaşımdaki sitokinler ve hormonlar 3 gibi bir uyarıcıya tepki olarak vasküler ve organ fonksiyonu modüle önemli bir rol oynar. endotel, kan arasındaki ayrıntılı etkileşimleri anlamak ve çevredeki doku mikro-damar biyoloji ve hastalığın ilerlemesi çalışma için önemlidir. In vivo mikrovasküler yapısında özetlemek ve 6,7 çalışmayan in vitro araçları sınırlı tarafından Ancak, bu etkileşimlerin incelenmesinde ilerleme engellemiştir edilmiştir. Sonuç olarak, saha ve tedavi ilerleme masraflı ve zaman-ağır güvendi10 – genellikle insanlarda 8 başarının çevirmek için başarısız hayvan modelleri tüketen. In vivo modeller hastalık mekanizmaları ve vasküler fonksiyonları çalışmada değerli olmakla birlikte, karmaşık ve çoğu kez bireysel hücresel, biyokimyasal hassas kontrolü ve biyofizik ipuçlarını yoksundur.
Vücutta damar sistemi optimize perfüzyon ve besin taşıma eş zamanlı olarak 11 sağlayarak, geniş kılcal yatak ile birlikte olgun hiyerarşik bir yapıya sahiptir. Başlangıçta, erken gelişme 12,13 sırasında hiyerarşik dallı bir ağa yeniden düzenleyen bir ilkel pleksus olarak damar formları. Bu süreçlerde yer alan sinyallerin çok iyi 14 anlaşılmış olmasına rağmen – 16, vasküler desenlendirme 15 nasıl belirlendiğini böyle zor kalır. Buna karşılık, organize damar ağları mühendisi in vitro bu süreci yansıtan arı vardırn zordur. Birçok mevcut in vitro platformları, iki boyutlu bir endotel hücre kültürleri olarak, bu tür çok hücreli yakınlığı, üç boyutlu bir lümen geometri, akış ve hücre-dışı matris olarak önemli özelliklerinin eksikliği, damar model. 3D hidrojeller tüp oluşumu deneyleri (kollajen veya fibrin) 17 – 19 veya istila deneyleri 20,21 diğer vasküler 17,22 veya doku hücre tipleri 23 ile 3D ve onların etkileşimleri endotel fonksiyonunu incelemek için kullanılır olmuştur. Bununla birlikte, bu deneylerde lümen birleştiricisi, hemodinamik akışı ve uygun perfüzyon eksikliği toplandı. Bundan başka, bu tüp oluşumu deneylerinde 24 vasküler gerileme eğilimi gerçekleştirilebilir fonksiyonel çalışmalar derecesini sınırlar süren uzun süreli kültürleri ve olgunlaşmasını önler. Böylece, uygun model olabilir mikrovasküler ağlarının en in vitro platformları mühendisi gelişen ihtiyaç vardırözelliklerini dothelial ve uzun süreli kültür yeteneğine sahiptirler.
vasküler mühendislik teknikleri çeşitli damar hastalığı olan hastalarda değiştirmek için medikal uygulamalar veya bypass etkilenen gemiler için yılda ortaya çıkmıştır. Polietilen tereftalat (PET) ve politetrafloroetilen (ePTFE) gibi sentetik malzemelerden yapılmış geniş çaplı damarları uzun dönem açıklık (ortalama% 95 açıklığının 5 yıldan fazla) 25 ile önemli bir terapötik başarı oldu. Küçük çaplı sentetik greft (<6 mm) tipik olarak intimal hiperplazi ve trombopoezde 26 gibi komplikasyonların karşı karşıya olmasına rağmen – doku biyolojik malzeme ile yapılmış küçük çaplı greft mühendislik 28, önemli ilerlemeler 29,30 yaptık. Bu tür ilerlemelere rağmen, böylece mikro üzerine tasarlanmış kaplar bir sorun kalmıştır. yeterli mikrovaskuleterini modellemek için, Suf karmaşık bir ağ desenleri oluşturmak için gerekli olanficient mekanik dayanım açıklığını ve parankimal hücreleri ve hücre yenileme için hem besin nüfuz sağlayan bir matris kompozisyonu ile korumak için.
34 – Bu protokol ayarlanabilir ve kontrol edilebilir mikroçevresinin 31 ayar in vivo bir yerli taklit eden bir roman yapay perfusable damar ağı sunuyor. tarif edilen yöntem, 100 um mertebesinde çapları ile mühendislik mikrodamarlar oluşturur. Engineered mikrodamarlar Ben hidrojel kollajen yumuşak türü içinde gömülü olduğu bir mikroakışkan kanal aracılığıyla endotel hücreleri perfüze tarafından üretilmektedir. Bu sistem, açık lümen yapı ile desenli ağlar oluşturmak çoklu hücresel etkileşimleri çoğaltmak, hücre dışı matris bileşimi modüle eden ve fizyolojik olarak uygun hemodinamik kuvvetleri uygulamak için kapasiteye sahiptir.
Engineered mikrodamarlar gibi lümen geometri, hidrodinamik kuvvetler ve çok hücreli etkileşimler gibi fizyolojik özellikleri mevcut ve ayarlanabilir olduğu bir in vitro model vardır. Platformun bu tip ve model in vitro kültür koşulları, söz konusu mikro-o eşleştirilebilir çeşitli bağlamlarda endotel davranışını incelemek olanağı sunar ki güçlüdür. Örneğin, damar endotel işlemleri, sürücü mekanizmaları, farklı organlarda ve sağlık ve hastalık 44 gibi fark…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Kök Hücre ve Rejeneratif Tıp yanı sıra Washington Üniversitesi Washington Nanofabrikasyona Tesisi Enstitüsü Lynn ve Mike Garvey Görüntüleme Laboratuvarı kabul etmek istiyorum. Onlar da Ulusal Sağlık Enstitüsü maddi destek kabul (YZ) DP2DK102258 verir, eğitim ve (MAR) T32HL007312 (SSK ve MAR) T32EB001650 verir.
Wafer Fabrication | |||
AutoGlow Plasma System | AutoGlow | ||
Headway Spin Coater | Headway Research, Inc | PWM32 Spin Coater | |
ABM Contact Aligner | AB-M | ||
Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
8" silicon wafer | Wafer World Inc. | ||
Tabletop Micro Pattern Generator | Heidelberg Instruments | μPG 101 | For generation of photomask |
Hot plate | VWR | 97042-646 | |
Ispropyl alcohol | Avantor Performance Materials | 9088 | |
Petri dishes (120 x 120 mm, square) | Sigma-Aldrich | Z617679 | |
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silane | Sigma-Aldrich | MKBG3805V | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base and curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 | Mixed at 10:1 (w/w) |
Vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
Oven | VWR | 9120976 | |
Device Fabrication and Culture | |||
poly(methyl methacrylate) (PMMA) | Plexiglas | ||
Corona Treater | Electro-Technic Products, Inc. | BD-20 | Handheld device for plasma treatment of PMMA devices and PDMS molds |
Soldering Iron | Weller | WTCPS | |
Stainless Steel Truss Head Slotted Machine Screw | McMaster-Carr | 91785A096 | |
Stainless steel dowel pins | McMaster-Carr | 93600A060 | |
Tweezers | Miltex | 24-572 | Any similar tweezers may be used |
Spatula (Micro Spoon) | Electron Microscopy Services | 62410-01 | |
Screw driver | Any flat head screwdriver may be used, autoclaved | ||
Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542B | |
Bleach | Clorox | 4460030966 | |
Petri dishes (150 X 25mm) | Corning | 430599 | |
Petri dishes (100 X 20 mm) | Corning | 2909 | |
Cotton, cut into 1 cm x 3 cm pieces | Autoclaved | ||
Polyethyleneimine (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute to 1% in cell culture grade water |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | Dilute to 0.1% in cell culture grade water |
Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
Type I collagen, dissolved in 0.1% acetic acid | Isolated from rat tails as described in Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
1 mL syringe | BD | 309659 | |
10 mL syringe | BD | 309604 | |
15 mL conical tubes | Corning | 352097 | |
30 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
M199 10X Media | Life Technologies | 11825-015 | |
1N NaOH (sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1N in cell culture grade water |
HUVECs | Lonza | ||
Endothelial growth media | Lonza | CC-3124 | |
Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
Dextran from Leuconostoc spp. (70kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
Hemocytometer | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
Gel loading tips | VWR | 37001-152 | |
18G Blunt Fill Needle | BD | 305180 | |
20G Stainless Steel Dispensing Needle | McMaster-Carr | 75165A123 | |
Tygon 1/32” ID, 3/32" OD Silicon Tubing | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
1/16" Tube-to-tube Coupling | McMaster-Carr | 5116K165 | |
90° Elbow Connectors, Tube-to-Tube | McMaster-Carr | 5121K901 | |
Luer Lock Coupling (Female, 1/16" ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
Plastic Forceps, with Jaw Grips | Electron Microscopy Services | 72971 | |
Dual Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Fisher Scientific | 14-959-2A | |
Device Analysis | |||
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8806-5G | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
Rabbit anti-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 working dilution |
FITC conjugated anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | ab8822 | 1:100 working dilution |
Goat anti-rabbit 568 secondary antibody | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 working dilution |
Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | Resuspended in DMSO |
Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | To make 0.2M cacodylate buffer |
Ethanol | VWR International | BDH1164-4LP | |
40kDa FITC-conjugated Dextran | Sigma-Aldrich | FD40S | |
Additional Culture Reagents | |||
CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | Small molecule GSK-3 inhibitor |
Human recombinant VEGF | Peprotech | 100-20 | |
Human recombinant bFGF | Peprotech | AF-100-18B |