Riktad Protein Förpackning inom yttre membranvesiklar från<em> Escherichia coli</em>: Design, produktion och rening

Summary

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Abstract

Ett ökande intresse av att syntetisk biologi tekniker för att programmera yttre membranvesiklar (OMV) leder till några mycket intressanta och unika applikationer för OMV där traditionella nanopartiklar har visat alltför svårt att syntetisera. Hittills har alla gramnegativa bakterier visats producera OMV demonstrera förpackning av en mängd gods som inkluderar små molekyler, peptider, proteiner och genetiskt material. Baserat på deras varierande last, är OMV inblandade i många biologiska processer som sträcker sig från cell-cellkommunikation till genöverföring och leverans av virulensfaktorer beroende på vilka bakterier producerar OMV. Först nyligen har bakteriell OMV blivit tillgängliga för användning inom ett brett spektrum av applikationer genom att utveckla metoder för att styra och direkt paketering av rekombinanta proteiner i OMV. Detta protokoll beskriver en metod för framställning, rening och användning av enzym förpackade OMV föreskriver förbättrad Overall produktion av rekombinant enzym, ökad blåsbildning, och förbättrad stabilitet enzym. Framgångsrik användning av detta protokoll kommer att leda till skapandet av en bakteriestam som samtidigt producerar ett rekombinant protein och styr det för OMV inkapsling genom att skapa en syntetisk koppling mellan det rekombinanta proteinet och ett yttre membranförankringsprotein. Detta protokoll också detaljer metoder för att isolera OMV från bakterieodlingar samt korrekt hantering tekniker och saker att tänka på när anpassa detta protokoll för användning för andra unika applikationer såsom: läkemedels drug delivery, medicinsk diagnostik och miljöåterställning.

Introduction

Som presenteras här är en metod för konstruktion, tillverkning och rening av enzymbelastade bakteriella yttre membranvesiklar (OMV). OMV är små, främst unilamellära, proteoliposomer som varierar i storlek från 30 till 200 nm ^1,2. Alla gramnegativa och grampositiva bakterier som har studerats till dags dato har visat frisättning av antingen OMV eller extracellulära vesiklar (EV) från deras yta ^3,4. Den exakta mekanismen genom vilken OMV produceras ännu inte helt klarlagd på grund av de olika bakteriepopulationen som utsöndrar dem samt de olika funktioner som de tjänar. OMV har visat att transportera ett brett spektrum av last från små molekyler, peptider och proteiner till genetiskt material som serverar en mängd komplexa signalerings, gen translokation, och virulens funktioner ^5,6.

De exakta mekanismerna för OMV biogenes är inte väl karakteriserade, och tycks skilja mellan bakteriearter. trots this faktum, har vi utvecklat en metod för att förbättra packningseffektiviteten av ett rekombinant protein i OMV genom att skapa en syntetisk bindning mellan ett protein av intresse och en högt förekommande proteinet endogent för det bakteriella yttermembranet och efterföljande OMV. I avsaknad av en syntetisk koppling, eller artificiellt bildat affinitet mellan rekombinant uttryckta proteinet och OMV den observerade packningseffektiviteten är mycket låg ^7. Detta resultat är att vänta som inkorporering av proteinerna inom OMV antingen sker genom slumpen inkapsling i samma ögonblick av OMV bildning vid bakterieytan eller genom riktad förpackningar av mekanismer som inte är väl förstådda. Viss framgång har observerats i förpacknings proteiner helt enkelt genom överuttryck i det periplasmatiska utrymmet som förlitar sig på slumpen inkapsling men effektiv förpackning är hög proteinberoende med vissa proteiner förpackning med hög effektivitet jämfört med andra thpå inte paket alls ^8-10. Genom att utnyttja gemensamma syntetisk biologiska tekniker försökte vi ingenjör Escherichia coli (E. coli) för att samtidigt producera, paketera och utsöndra ett aktivt enzym av intresse i OMV som kringgår aktuella kunskaps begränsningar för hur OMV bildas och hur lasten väljs av bakterierna för förpackning.

Vid tillämpningen av denna ansökan ett delat protein biokonjugering systemet valdes som den syntetiska länk val för att underlätta riktad förpackning i OMV. Som namnet antyder en delad protein biokonjugering Systemet består av två komplementära subenhet domäner som interagerar med varandra. De delade proteindomäner som valts ut inom ramen för detta protokoll kallas den Spycatcher (SC) och SpyTag (ST) domän och härrör från Streptococcus pyogenes fibronektin-bindande protein (FbaB) ^11. Denna uppdelning proteinsystem är ovanligt i att whöna de två subenheter är inom närhet en isopeptidbindning bildar spontant mellan den proximala asparaginsyra och lysin aminosyrarester skapar en kovalent bindning. Isopeptidbindning bildning kräver inte tillsats av chaperonproteiner, katalytiska enzymer eller kofaktorer och kan lätt ske vid rumstemperatur (RT) och över ett brett område av fysiologiskt relevanta villkoren ^12.

Som en proof of concept, var phosphotriesterase (PTE) (EG 3.1.8.1) från Brevundimonas diminuta väljs för att packas i E. coli erhållet OMV ^13. PTE innehåller en binukleär Zn / Zn aktiv plats och har förmågan att bryta ner organiska fosforföreningar genom en hydrolysreaktion konvertera aryldialkylphosphates i dialkylphosphates och arylalkoholer ^14. Exponering för organofosfater försämrar korrekt neurotransmittorfunktion genom att hämma hydrolys av acetylkolin genom acetylkolinesteras vid neuromuskulära korsningar making fosfororganiska härledda föreningar extremt farliga ^15. Långvarig eller betydande exponering mot organofosfater resulterar vanligtvis i okontrollerbara kramper och vanligtvis leder till döden via kvävning. Medan PTE uppvisar den högsta katalytiska aktiviteten mot paraoxon, en mycket potent insekticid, är det också förmåga att hydrolysera ett brett spektrum av andra pesticider och V / G Typ kemiska nervmedel ^16. För att underlätta OMV förpackning ades en bakteriell plasmid utformad som kodar en genkonstruktion som innehåller en inducerbar promotor, ett periplasmatiskt lokaliseringssekvens, och en kort multipelt kloningsställe uppströms om SC-gensekvensen. Insättning av PTE-genen mellan ledaren och SC-sekvens möjliggjorde skapandet av en genetisk switch som riktar PTE-SC-fusionsprotein till det periplasmatiska utrymmet för OMV förpackning. Medan de ansträngningar som beskrivs här fokuserar på PTE, är enzymgenen utbytbara och kan lätt ersättas med en annan gen-sekvensen med FACilitate förpackning av ett alternativt enzym eller protein.

Som den andra delen av den syntetiska koppling, är en riklig yttre membranprotein (OmpA) valt att presentera ST-peptidsekvensen. Medan valet av förankringsproteinet kan variera, är det väsentligt att proteinet har en tillåtande domän som presenteras inom det periplasmatiska utrymmet, tolererar fusionskonstruktionen utan att inducera cytotoxicitet, är känd för att vara närvarande i OMV, och sammanställer inte när det är rekombinant produceras. OmpA är en 37,2 kDa trans porin protein som är känt för att vara mycket uttryckas i bakterieyttermembranet och efterföljande OMV ^17. Det är inblandad i transporten av små molekyler, <2 nm i storlek, över bakteriemembranet ^18. Nativt OmpA har två strukturellt unika domäner, en transmembran beta fat motiv och en periplasmically löslig C-terminala delen kända för att interagera med peptidoglykan ^19. I mutanten OmpA-ST fusion designed här den C-terminala delen av OmpA ströks och ST fuserades till den periplasmically vänd N- eller C-terminaler. Radera periplasmatiska delen av OmpA minskar antalet interaktioner mellan det yttre membranet och peptidoglykan resulterar i membranet destabilisering leder till hyper-blåsbildning ^7. Genomisk OmpA bibehölls utöver den rekombinant uttryckta OmpA-ST-konstruktionen för att mildra grov membran destabilisering.

Protocol

1. Framställning av plasmider Förbered en plasmid (t.ex. pET22) innehåller ankar protein (OmpA) smält till en biortogonal länk domän (som avses i detta protokoll som ankare-ST), epitopmärkning (såsom 6xHis, myc eller FLAG taggar för rening och identifiering), periplasmisk lokalisering tag, antibiotikaresistens, och lämplig replikeringsursprung baserat på den valda bakteriestam 7. Utdrag plasmid DNA från övernattskulturer med hjälp av en kommersiellt tillgänglig DNA-…

Representative Results

Samtidig expression av två rekombinanta proteiner, som erfordras för OMV förpackningsstrategi som beskrivs i detta protokoll, kan åstadkommas genom ett antal olika vägar. Här var en två vektorsystem används med kompatibla ursprung för replikation och separata inducerbara gen kassetter. För expression av PTE-SC konstruera en kommersiell plasmidryggrad (pACY184) var konstruerad för att inkludera en arabinos inducerbar gen kassett och en tvilling arginin periplasmisk lokalisering…

Discussion

Detta protokoll funktioner för att visa en representativ riktad förpackningsteknik där ett enzym av intresse produceras och förpackas i OMV av E. coli. Som med många komplexa tekniker det finns flera områden där protokollet kan modifieras för att rymma för användning i olika unika applikationer, av vilka några beskrivs nedan. Medan mekanismen för OMV förpackningar och enzym inkapsling kan anpassas till specifika behov finns flera steg i detta protokoll som är avgörande för dess framgång. Den in…

Materials

IPTG	Any		Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose	Any		Can be prepared ahead of time and stored at 4C.
Ampicillin	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
Chloramphenicol	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
TB/LB Culture Media	Any		Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100	Any		One of many potential suitable surfactants.
Baffled culture flasks	Any		The baffles promote higher levels of aeration.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.
Syringe Filter 0.45 µm	Thermo Scientific	60183-221       (30 mm)	Filter diameter will depend on volume of sample.  Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator	New Brunswick	Excella E24	Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.
Sorvall Culture Centrifuge	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor	Thermo Scientific	AH-629	Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes        (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer	Tecan	Infinite M1000	Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS / particle tracking	NanoSight	LM10	Necessary for OMV size distribution and concentration determination.
BL21(DE3)	NEB		Suitable bacterial expression strain.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Other plasmids can be used in place of these.
pACYC184	NEB		Other plasmids can be used in place of these.
Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Example kit.