Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.
שכיחות מחלות מעי דלקתיות, כלומר, מחלת קרוהן וקוליטיס כיבית, גדל באופן משמעותי בעשור האחרון. האטיולוגיה של IBD נותרת עלומה ואסטרטגיות טיפוליות נוכחיות מבוססות על הדיכוי הנוקב של מערכת החיסון. פיתוח טיפולים שמתמקדים דלקת מעיים וריפוי הפצע אפיתל יכול לשפר באופן משמעותי וניהול של IBD, אך זה דורש זיהוי מדויק של שינויים דלקתיים. נכון לעכשיו, לתרופות פוטנציאליות בדרך כלל מוערכות באמצעות מודלים של בעלי חי in vivo או עם טכניקות המבוססות תרבות תאים במבחנה. בדיקה היסטולוגית בדרך כלל דורשת את התאים או רקמות של עניין להיצבע, אשר עשוי לשנות את מאפייני מדגם ויתר על כן, הפרשנות של ממצאים יכול להשתנות לפי מומחיות חוקרת. מיקרוסקופיה הולוגרפית הדיגיטלית (DHM), מבוסס על זיהוי של עיכוב מרחק אופטי, מאפשרתכתם ללא הדמיה בניגוד כמותית שלב. זה מאפשר את התוצאות להיות מתואמים ישירות עם פרמטרים biophysical מוחלט. אנו מדגימים כיצד מדידת שינויים בצפיפות רקמה עם DHM, המבוססת על מדידה מקדמת שבירה, יכולה לכמת שינויים דלקתיים, ללא כתמים, בשכבות שונות של דגימות רקמה גסות מעכברים ובני אדם עם קוליטיס. בנוסף, אנו מדגימים ניטור ללא תווית multimodal רציפה של ריפוי פצע אפיתל במבחנה, אפשרית באמצעות DHM באמצעות הקביעה האוטומטית הפשוטה של האזור הפצוע ונחישות סימולטני של פרמטרים מורפולוגיים כגון מסה יבשה ועובי שכבת תאים נודדים. לסיכום, DHM מייצג כלי רב ערך, רומן וכמותיים להערכת דלקת מעיים עם ערכים מוחלטים עבור פרמטרים מותרים, כימות פשוטה של ריפוי פצע אפיתל במבחנה ולכן יש פוטנציאל גבוה u אבחון translationalse.
מחלות מעי דלקתיות (IBD), כלומר, קוליטיס כיבית (UC) ומחלת קרוהן (CD) הם מחלות דלקתיות אידיופטית של מערכת העיכול 1. מחקר לתוך הפתופיזיולוגיה הבסיסית של IBD והערכה תרופות פוטנציאליות חדשות או גישות אבחון חדשות ומתקדמות במיוחד בעל חשיבות. בשני המחקר הבסיסיים בניהול הקליני של חולי IBD, רירית המעי הפכה למוקד של תשומת לב 2,3. רירית מייצג גבול אנטומיים, שבו יחסי הגומלין בין חיידקים commensal, תאי אפיתל מרכיבים תאיים שונים של מערכת החיסון במעי לתזמר הבטן הומאוסטזיס 4,5. עם זאת, בחולים במחלות מעי דלקתיות, דלקת מעיים בלתי מבוקרת ומתמשך מוביל הרירית נזק, לזיהוי כמו כיבים או היצרות, אשר בסופו של דבר יכול להגיע לפסגה בתוך התפלגות תפקוד המחסום אפיתל, שבעצמה מחריף המקומי דלקת 6.
<pclass = "jove_content"> אפיתל ריפוי פצעים לכן חיוני להתחדשות אפיתל הבא דלקת אך גם דרישת ליבה עבור ההחלמה של כיבים במערכת עיכול או דליפת anastomotic לאחר עיכול ניתוח 7. אפיתל ריפוי פצע ניתן לדמות ב פצע במבחנה בריפוי מבחנים במודלי Murine של דלקת מעי 8,9. הוא במבחנת in vivo יש גישות חסרונות, המגבילים את הדיוק של הערכת ניסוי. ב מבחני חוץ גופייה, כמו מבחני שריטה קלסיים, דורשים נהלים מכתימים ממושכים או transfection עם chromophores ניאון. הם מוגבלים לעתים קרובות על ידי התפשטות הניטור של תאים הרציף שלהם והגירו כי לא יכול להיות אוטומטית 10. מודלים בשנת vivo, כגון נתרן סולפט dextran (DSS) קוליטיס -induced, לעתים קרובות חסר-outs לקרוא חזק, בין שאר בשל הווריאציה המשמעותית לראות בסמני מעבדה, maמלך כגון סמנים ראויים להעריך חומרת קוליטיס 11,12. ניתוח היסטולוגית של הרירית המוסתת כרגע עדיין הגישה התקפה ביותר כדי לקבוע חומרת קוליטיס אבל זה, כמו במבחנת מבחני ריפוי פצע אפיתל, דורש מכתים והוא תלוי המומחיות של חוקר 13.לאחרונה מיקרוסקופיה הולוגרפית דיגיטלי (DHM), נגזרת של מיקרוסקופיה שלב כמותי 14, זוהה כלי שימושי להערכת ריפוי פצעים אפיתל במבחנה ובחי 15. DHM מאפשר הערכה של צפיפות רקמת ידי מדידת עיכוב מרחק אופטי (OPD) , 16-18 וכימותי שינויים ברקמה המתלווה לדלקת 19 אשר אבחן רומן סרטן הסיכויים. בנוסף, DHM מאפשר ניטור של דינמיקת מורפולוגיה תאים על ידי קביעת עובי תא, שטח פן מכוסה תא תאי כמות תוכן (חלבון) <sup> 15,20. ב מבחני חוץ גופית, DHM גם מאפשרת ניתוח של תהליכים פיזיולוגיים, למשל, חדירות מים הסלולר על ידי הערכת שינויים נפח תא ועובי 21,22. יתר על כן, מדידות DHM יכולות להיות אוטומטיות המונעת הטיה במדגם קשור חוקרת.
הנה, אנחנו מדגימים את השימוש DHM במודל Murine של דלקת מעיים, וגם ליישם DHM ניתוח של דגימות רקמות אדם לניטור כמותי של ריפוי פצעים כמו assay ללא תווית במבחנה. ראשית, אנו מעריכים שינויים דלקתיים של שכבות קיר גסות שונות בעכברי colitic וחתכי רקמות מבני אדם עם IBD. לאחר שתיאר את ההליך בשלב הדמיה כמותי DHM, אנו מספקים הנחיות מפורטות לשימוש מרכיבי מיקרוסקופ, הכנת קטעי רקמה וגם לתאר את ההערכה של תמונות שלב כמותית רכשה.
לאחר מכן, אנו מראים כי DHM יכול להיות UTIlized לניטור multimodal רציף של ריפוי פצעים אפיתל במבחנה, ולתאר את ניתוח מאפיינים הסלולר כמו עובי שכבת תאים, מסה יבשה ונפח הסלולר לתת תובנה שינויי תא תרופה מושרה ואת פיסיולוגי.
אנו מראים כי DHM מספק הערכה מדויקת של ניזק היסטולוגית במודלים קוליטיס בעכברי דגימות רקמה גסה אנושיות vivo לשעבר. יתר על כן, אנו לראות DHM יכול לפקח ריפוי פצע אפיתל ברציפות תוך מתן מידע multimodal זמנית על שינויים הסלולר. ב DHM, השחזור של הולוגרמות שנתפסו דיגיטלי מבוצע 32</sup…
The authors have nothing to disclose.
We thank Faekah Gohar for proofreading the manuscript. We thank Sonja Dufentester and Elke Weber for expert technical assistance.
Reagents | ||
Azoxymethane (AOM) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 |
Cell Culture Flask | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 658170 |
Costar Stripette | Corning Inc., New York, USA | 4488 |
Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 |
DMEM/Ham´s F12 | PAA Laboratories – Pasching – Austria | E15-813 |
EGF | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | SPR3196 |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 |
Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
Isopentane (2- Methylbutane) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L |
Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 |
Mitomycin C | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | M4287 |
Microscope Slides | G. Menzel, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ |
O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 |
Pen/Strep/Amphotericin B | Lonza, Verviers, Belgium | 1558 |
Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 |
RPMI 1640 | Lonza, Verviers, Belgium | 3626 |
Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 |
Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 |
Trypsin EDTA | Lonza, Verviers, Belgium | 7815 |
Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 |
µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high | ibidi GmbH, Munich, Germany | 81176 |
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert | ibidi GmbH, Munich, Germany | 80050 |
Equipment | ||
MICROM HM550 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA | 46320 |
Digital holographic microscope | ||
Component | Model | Company |
Inverted Microscope | iMIC | Till Photonics, Graefelfing, Germany |
Laser | Compass 315M | Coherent GmbH, Luebeck, Germany |
Microscope lens | Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 | Zeiss, Goettingen, Germany |
CCD camera | DMK 41BF02 | The Imaging Source, Bremen, Germany |