JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

उपन्यास फ्लोरोसेंट जांच के साथ प्लाज्मा झिल्ली में Phosphatidylinositol 4,5-बाइफोस्फेट की एकल अणु सुपर संकल्प इमेजिंग

Published: October 15, 2016
doi:
10.3791/54466
,
1Department of Neuroscience,University of Wisconsin-Madison

Summary

पीआई (4,5) पी 2 विभिन्न सेलुलर कार्यों को नियंत्रित करता है, लेकिन सेल प्लाज्मा झिल्ली में अपनी nanoscale संगठन खराब समझा जाता है। लेबलिंग पीआई (4,5) एक दोहरी रंग फ्लोरोसेंट Pleckstrin अनुरूपता डोमेन के लिए जुड़े हुए जांच के साथ पी 2 के द्वारा, हम पीआई अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण (4,5) पी प्लाज्मा झिल्ली में 2 स्थानिक वितरण nanometer पैमाने पर वर्णन ।

Abstract

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

Introduction

Phosphoinositides कुल झिल्ली लिपिड के एक छोटे से हिस्से के लिए योगदान है, लेकिन सेलुलर प्रक्रियाओं की एक किस्म में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वे सात सदस्यों 3 आरडी पर प्रतिवर्ती फोस्फोराइलेशन या inositol के छल्ले के dephosphorylation से निकाली गई, 4 वें और 5 वें स्थान 1 शामिल हैं। Phosphatidylinositol 4-फॉस्फेट (PI4P) और phosphatidylinositol 4,5-बाइफोस्फेट (पीआई (4,5) पी 2) दो प्रमुख phosphoinositides कि अपेक्षाकृत स्वतंत्र रूप से कार्य सेल प्लाज्मा झिल्ली (प्रधानमंत्री) 2,3 के निर्धारक लिपिड के रूप में कर रहे हैं। Phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (रंज 3) बहुत कम PI4P और पीआई (4,5) पी 2 की तुलना में प्रचुर मात्रा में है, लेकिन यह कैंसर और मधुमेह 4 5 सहित विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं में अद्वितीय कार्य किया है। ये लिपिड उनकी प्रभावोत्पादक और कई अन्य प्रोटीन के साथ जटिल आणविक बातचीत की है। इसलिए, यह इन फोटो के स्थानिक संगठन को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैnanometer पैमाने पर प्रधानमंत्री में sphoinositides।

बढ़ते सबूत से पता चला है कि प्रोटीन परिसरों या सीमित PM क्षेत्रों में अणु समूहों के आकर्षण के केंद्र 6 संकेत के रूप में सेवा कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, syntaxin 1 ए, एक महत्वपूर्ण प्रोटीन है कि झिल्ली संलयन 7-9 नियंत्रित करता है, प्रधानमंत्री में क्लस्टर संगठन को प्रदर्शित करता है। syntaxin 1 ए का क्लस्टर संगठन का सर्वसम्मत विचार से अलग, प्रधानमंत्री में phosphoinositides के स्थानिक वितरण विवादास्पद है। पीआई (4,5) पी 2 वितरण पैटर्न वर्दी 10-12, बड़े पैच 13,14 से लेकर, समूहों 14-18, सेल प्रकार पर निर्भर करता है और प्रायोगिक तरीकों का इस्तेमाल किया घने। उच्च संकल्प पर की पीआई (4,5) पी 2 स्थानिक संगठन भी असंगत है। उत्तेजित उत्सर्जन कमी का उपयोग कर एक अध्ययन (STED) माइक्रोस्कोपी 19 घने पीआई (4,5) पी 2 नैनो-समूहों की एक बड़ी संख्या से पता चला है (~ व्यास में 73 एनएम) पीसी -12 कोशिकाओं 20 के प्रधानमंत्री शीट में </s> अप। यह परिणाम जल्दी ठंड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) 21,22, एक दृष्टिकोण है कि जीवित कोशिकाओं के बरकरार PM संरचना ज्यादा रासायनिक निर्धारण की तुलना में बेहतर बरकरार रखता का उपयोग अध्ययन से अलग है। बाद के पीआई (4,5) पी 2 के अलग ताल से पता चला है; अपेक्षाकृत केंद्रित पीआई (4,5) caveolae और लेपित गड्ढों में पी 2 के साथ ही फ्लैट PM क्षेत्र पर समान वितरण। इसके अलावा, nanoscale पीआई (4,5) पी झिल्ली शीट में 2 संगठन रहते हैं और तय कोशिकाओं में अलग हो सकता है। हमारे हाल ही में काम एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (SMLM), 23 का उपयोग करते हुए दोनों तय की और रहते आईएनएस-1 कोशिकाओं में इस मुद्दे की जांच की।

SMLM प्रसंभात्य किसी भी समय में केवल fluorophores के एक छोटे सबसेट पर स्विच इतना है कि व्यक्ति fluorophores उच्च परिशुद्धता के साथ अनुवादित किया जा सकता है पर आधारित है। कई सुपर संकल्प इमेजिंग दृष्टिकोण समान सिद्धांतों का उपयोग पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के विवर्तन सीमा पार करने के लिए विकसित किया गया है, इस तरह के एकएस photoactivation स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम), 24, प्रतिदीप्ति photoactivation स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (FPALM) 25, स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) 26,27 और प्रत्यक्ष तूफान (dSTORM) 28। फोटो-switchable या photoactivatable fluorophores (रंगों या फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के साथ, SMLM तकनीक जीवित कोशिकाओं 31,32 में नैनोमीटर संकल्प 24,29,30 वीडियो-दर के साथ छवि जैविक संरचनाओं के लिए वैज्ञानिकों को अनुमति देते हैं।

एक उदाहरण के रूप पीआई (4,5) पी 2 का उपयोग करना, हम पर प्रधानमंत्री phosphoinositides के nanoscale वितरण का अध्ययन करने के SMLM दृष्टिकोण पेश किया। PLCδ1 (phospholipase सी δ1) है कि विशेष रूप पीआई के लिए बांध का पीएच डोमेन (4,5) पी 2 PM में इमेजिंग पीआई (4,5) पी 2 उप सेलुलर वितरण और गतिशीलता 33,34 के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित है जांच । हम आनुवंशिक रूप से दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन, PAmCherry1 35 और 36 iRFP के साथ इस डोमेन टैग </sup> एक दोहरी रंग संलयन प्रोटीन (iRFP-PAmCherry1-पीएच PLCδ1) का उत्पादन करने के लिए (चित्रा 1 ए-बी)। PAmCherry1 पाम के लिए शारीरिक रूप से विकलांग डोमेन के photoactivatable जांच के रूप में कार्य करता है और iRFP एक सामान्य सूचक पाम अधिग्रहण से पहले ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान के रूप में कार्य । हम निश्चित झिल्ली शीट में SMLM इमेजिंग के लिए यह दोहरी रंग फ्लोरोसेंट जांच लागू होते हैं। लाइव पाम इमेजिंग के लिए, हम mEOS3 37 के बजाय PAmCherry1 टैग की पीएच PLCδ1 डोमेन के लिए अपनी बेहतर फोटॉन दक्षता और चमक (चित्रा 1 सी-डी) के लिए mEOS3.1-पीएच PLCδ1 जांच उत्पन्न करने के लिए।

इंसुलिन स्रावित आईएनएस-1 कोशिकाओं 38 के पीएम इन उपन्यास जांच के साथ SMLM इमेजिंग पीआई (4,5) प्रधानमंत्री क्षेत्रों के बहुमत में पी 2 के साथ ही केंद्रित पीआई (4,5) पी 2 के सजातीय लेबलिंग का पर्दाफाश किया है microdomains कि कम फ्लैट प्रधानमंत्री और कुछ filopodia संरचनाओं की तरह 23 में intermixed रहे हैं। फिर एकके पीआई (4,5) पी 2 noscale वितरण पुनर्विचार यह कैसे जीवित कोशिकाओं में कार्यों के लिए एक संरचनात्मक आधार देता है।

Protocol

1. झिल्ली पत्र तैयार करना और फिक्सेशन IRFP-PAmCherry1-पीएच पीएलसी δ1 के साथ लेबल झिल्ली शीट तैयार डीएनए प्लाज्मिड एन्कोडिंग iRFP-PAmCherry1-पीएच पीएलसी मानक आणविक जीव विज्ञान तकनीक का उपयोग कर δ1 23 तैयार करें। संस्कृति आईएनएस-1 # 1.5 पर कोशिकाओं 18 मिमी दौर coverslips 30 माइक्रोग्राम प्रति मानक आईएनएस-1 सेल संस्कृति प्रोटोकॉल 38,39 निम्नलिखित 50-70% confluency करने के लिए / एमएल fibronectin के साथ पूर्व में लिपटे। कोशिकाओं को एक दिन transfect के बाद 50 से 70% confluency तक पहुँच जाता है। IRFP-PAmCherry1-पीएच पीएलसी के साथ Transfect कोशिकाओं निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन liposome अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग δ1। अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं। प्रयोग के दिन, कोट coverslips (एक तरफ) ~ 0.5 के साथ – 1 500 माइक्रोग्राम / एमएल पाली-D-लाइसिन की मिलीलीटर, 1-2 घंटे के लिए (पीडीएल DH 2 हे में पतला)। तब पर एक टिशू पेपर रखकर पीडीएल नालीcoverslip के किनारे। एक पूर्व ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) धातु बाद में उपयोग के लिए थाली पर coverslips रखें। 1 मिलीलीटर ठंडा फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) युक्त 1 मिमी EGTA – साथ ~ 0.5 coverslips पर बढ़ती पूर्व ट्रांसफ़ेक्ट आईएनएस-1 कोशिकाओं को धो लें। धोने तीन बार दोहराएँ और पीबीएस नाली। संवर्धित कोशिकाओं (सेल नीचे की ओर का सामना करना पड़) चिमटी की एक जोड़ी के साथ एक पूर्व ठंडा धातु की थाली पर पीडीएल लेपित coverslips पर साथ coverslips रखें। 7 के लिए एक रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में थाली छोड़ दो – 10 मिनट पीडीएल कोशिकाओं लेपित coverslips (चित्रा 2) को संलग्न करने की अनुमति है। नोट: ऊष्मायन समय 7 की सीमा में होना चाहिए – पीडीएल लेपित सतह के लिए कोशिकाओं की बेहतर कुर्की के लिए 10 मिनट। रेफ्रिजरेटर के माहौल से सूखा है और ऊष्मायन बहुत लंबा नहीं होना चाहिए। रेफ्रिजरेटर से धातु की थाली निकालें। धीरे चिमटी का उपयोग कर पूर्व ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से युक्त coverslip दूर छील। इस पर कोशिका झिल्ली शीट की एक पतली परत का उत्पादनपीडीएल लेपित coverslip। धीरे ~ 0.5 के साथ झिल्ली शीट धो – 1 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस और फिर ~ 0.5 के साथ ठीक – 1 मिलीलीटर ठंडा 4% paraformaldehyde (पीएफए) + 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.2% glutaraldehyde (जीए)। सावधानी: paraformaldehyde और glutaraldehyde विषाक्त कर रहे हैं। उन्हें त्वचा और आंखों की सुरक्षा के साथ एक धूआं हुड में संभाल लेना। निर्धारण के बाद, छवि झिल्ली शीट तुरंत (धारा 3 देखें) या ~ 0.5 में दुकान – 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर पीबीएस। नोट: झिल्ली पत्र फिक्सिंग के बाद, वहाँ कोई cytosol से पीआई (4,5) पी 2 के लिए शारीरिक रूप से विकलांग जांच के बंधन संतुलन होगा। बाध्य पीएच जांच धीरे-धीरे झिल्ली चादर से अलग कर देना और समाधान में फैलाना है (हालांकि यह सप्ताह के लिए दिन लग सकता है) होगा। इसलिए, यह सही नमूना तैयार करने के बाद छवि के लिए सिफारिश की है तय नमूने हैं। पीआई (4,5) पी 2 विशिष्ट एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए झिल्ली शीट तैयार संस्कृति आईएनएस-1 # 1.5 पर कोशिकाओं, 18 मिमी दौर coverslips 30 और के साथ पूर्व में लिपटे# 181; जी से 50 / एमएल fibronectin% -70% संगम। डीएनए के साथ Transfect कोशिकाओं कदम 1.1.3 में वर्णित के रूप में अगले दिन प्लाज्मिड। 1.1.4 से दोहराएँ कदम के रूप में ऊपर वर्णित 1.1.7 करने के लिए। नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर निम्नलिखित प्रक्रियाओं का प्रदर्शन। 1 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस युक्त 50 मिमी एनएच 4 सीएल – ~ 0.5 के साथ तय PM शीट तीन बार युक्त coverslips धो लें। ~ 0.5 के साथ चादरें बुझाना – 7 मिनट के लिए पीबीएस में 1 मिलीलीटर 0.1% सोडियम borohydride, और से धो लें ~ 0.5 – 1 मिलीलीटर पीबीएस (बिना 50 मिमी एनएच 4 सीएल)। 1 मिलीलीटर अवरुद्ध समाधान 45 मिनट के लिए (पीबीएस 5% (वी / वी) सामान्य बकरी सीरम, 5% (वी / वी) गोजातीय सीरम albumin और 50 मिमी एनएच 4 सीएल युक्त समाधान) – ~ 0.5 के साथ नमूने ब्लॉक। 1 घंटे के लिए समाधान को रोकने में: (300 कमजोर पड़ने 1) 1 मिलीलीटर प्राथमिक पीआई (4,5) पी 2 एंटीबॉडी – तो फिर, साथ ~ 0.5 सेते हैं। 1 मिलीलीटर पीबीएस युक्त 50 मिमी एनएच 4 सीएल – ~ 0.5 के साथ तीन बार (10 मिनट प्रत्येक समय) धो लें। 1 मिलीलीटर माध्यमिक एफ (एबी) 2-बकरी-विरोधी माउस – साथ ~ 0.5 नमूने सेतेएंटीबॉडी fluorophores (1: 300) के साथ संयुग्मित 1 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध में। 1 मिलीलीटर पीबीएस – ~ 0.5 के साथ तीन बार धोएं। साथ के बाद तय नमूने 4% पीएफए ​​+ 0.2% जीए 15 मिनट के लिए, तो नमूने तीन बार पीबीएस (7 मिनट प्रत्येक समय) से धो लें। इमेजिंग के लिए धारा 3 के लिए आगे बढ़ना है या बाद में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ~ 0.5 ~ 1 मिलीलीटर पीबीएस में दुकान। नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने तैयार करें। प्रधानमंत्री में phosphoinositides के शारीरिक वितरण संरक्षित करने के लिए 4% पीएफए ​​+ 0.2% जीए लगानेवाला का प्रयोग करें। आरटी तैयारी या 4% पीएफए के साथ अकेला निर्धारण महत्वपूर्ण कलाकृतियों (चित्रा 4) का कारण बन सकता है। 2. mEOS3.1-पीएच पीएलसी δ1 साथ लाइव सेल इमेजिंग के लिए सेल संस्कृति तैयारी के रूप में पहले 23 में वर्णित mEOS3.1-पीएच पीएलसी δ1 एन्कोडिंग डीएनए प्लाज्मिड तैयार करें। 30 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin जब तक वे तक पहुँचने के 50% -70% confl के साथ पूर्व में लिपटे संस्कृति आईएनएस-1 # 1.5 18 मिमी पर कोशिकाओं दौर coverslipsमानक आईएनएस-1 सेल संस्कृति प्रोटोकॉल 38,39 निम्नलिखित uency। अगले दिन, mEOS3.1-पीएच पीएलसी δ1 का उपयोग कर liposome अभिकर्मक अभिकर्मक निर्माण के प्रोटोकॉल के बाद डीएनए प्लाज्मिड के साथ आईएनएस-1 कोशिकाओं transfect। इमेजिंग से पहले 48 घंटे के लिए सेते हैं। झिल्ली शीट्स और लाइव प्रकोष्ठों के 3. पाम छवि अधिग्रहण झिल्ली चादरों की हथेली छवि अधिग्रहण नोट: यहाँ, एक कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोप आधारित SMLM प्रणाली (100x तेल, एपीओ, एनए = 1.49, WD 0.12 मिमी) 23 सब छवि अधिग्रहण के लिए प्रयोग किया जाता है। इमेजिंग से पहले, 10 मिलीलीटर पीबीएस + 50 मिमी 2 MgCl में फ्लोरोसेंट मनका समाधान के 1 μl पतला। 10 मिनट के लिए (कदम 1.1.8 / 1.2.6 से) इमेजिंग कक्ष युक्त सेल के नमूने में समाधान पतला 200 μl जोड़ें। फिर, पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। पाम इमेजिंग प्रणाली शुरू। जुड़े इमेजिंग सॉफ्टवेयर में, "iRFP चैनल का चयन और# 34; बटन (642 एनएम लेजर उत्तेजना, 700/75 एनएम उत्सर्जन)। कोशिका झिल्ली iRFP चैनल में पीएच जांच व्यक्त प्राप्त करें। ध्यान दें: झिल्ली चादर पास के एक फ्लोरोसेंट मनका होनी चाहिए। यह बाद में बहाव सुधार के लिए आवश्यक है। भविष्य छवि पुनर्निर्माण के लिए एक संदर्भ के रूप में iRFP चैनल में कोशिका झिल्ली का एक पारंपरिक TIRF छवि को इकट्ठा करने के लिए "कब्जा" बटन का प्रयोग करें। TIRF कोण इमेजिंग के लिए सेटिंग में 2140 में टाइप करके एक सामान्य TIRF कोण (यानी, महत्वपूर्ण कोण तक पहुंचने के बाद, एक और 1.5 डिग्री बारी) सेट करें। इस कोण सभी चरणों के लिए सेटिंग जब तक अन्यथा नोट का प्रयोग करें। नोट: TIRF प्रणाली यहाँ वर्णित में, 3,500 खड़ी अप कोण है, 2,200 TIRF महत्वपूर्ण कोण है, और 2140 सामान्य TIRF कोण है, जो TIRF महत्वपूर्ण कोण के बाद 1.5 डिग्री अधिक है। संकीर्ण TIRF कोण 3.2.3 में नीचे उल्लेख किया जो TIRF महत्वपूर्ण कोण तक पहुंचने के बाद एक और 2 डिग्री है 2120 है। वें क्लिक करके PAmCherry1 चैनल में स्विच करेंई आरएफपी चैनल बटन (561 एनएम उत्तेजना, 600/50 एनएम उत्सर्जन फिल्टर)। स्क्रॉल पट्टी "AOTF" पैड में पृष्ठभूमि झिल्ली प्रतिदीप्ति ब्लीच करने के लिए 10-20 सेकंड के लिए 561 एनएम लेजर की पूरी शक्ति रोशनी है करने के लिए सही करने के लिए सभी तरह से समायोजित करें। "स्वरूप" टैब और "एन डी अनुक्रम अधिग्रहण" टैब में तेजी से अधिग्रहण प्रोटोकॉल में इष्टतम कैमरा सेटिंग (2×2 binning) सेट (आमतौर पर 20 हर्ट्ज पर 10,000-40,000 चित्र)। "अब भागो" बटन पर क्लिक करके – एक निम्न स्तर (1% से 0.1%) पर एक साथ 405 एनएम लेजर सक्रियण के साथ PAmCherry1 छवियों (पूर्ण सत्ता में 561 एनएम लेजर, 50 मिसे / फ्रेम) का अधिग्रहण शुरू करो। 405 एनएम लेजर की तीव्रता को समायोजित इसलिए प्रत्येक फ्रेम में है कि स्थानिक अलग अलग-अलग अंक आसानी से पहचाने जा सकते हैं। नोट: सक्रिय PAmCherry1 अणुओं की संख्या अधिग्रहण के दौरान धीरे-धीरे कम हो जाती है। 405 एनएम लेजर तीव्रता धीरे-धीरे प्रत्येक में अलग-अलग अणु संकेतों के इष्टतम घनत्व रखने के लिए वृद्धि की जानी चाहिएफ्रेम। छवियों को प्राप्त जारी रखें जब तक कोई PAmCherry1 एक अणु के संकेत सक्रिय है। जीवित कोशिकाओं में पाम इमेजिंग इमेजिंग से पहले, 10 मिनट के लिए इमेजिंग कक्ष में फ्लोरोसेंट मोती पतला कदम 3.1.1 में वर्णित है। फिर जुड़े इमेजिंग सॉफ्टवेयर को खोलने के द्वारा पाम इमेजिंग शुरू करते हैं। नोट: लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक चुंबकीय जल्दी रिलीज इमेजिंग कक्ष का प्रयोग करें। 135 मिमी NaCl, 5.6 मिमी KCl, 2.6 मिमी 2 CaCl, 1.2 मिमी MgCl 2, 3 मिमी ग्लूकोज, और 20 मिमी: कोशिकी बफर (कोशिकी समाधान के साथ लगातार छिड़काव के तहत एक तापमान नियंत्रक के साथ 35 डिग्री सेल्सियस पर इमेजिंग क्षेत्र के केंद्र बनाए रखें HEPES, पीएच = 7.3)। GFP चैनल बटन (525/50 एनएम उत्सर्जन) चुनें। कोशिका झिल्ली 488 एनएम लेजर उत्तेजना के तहत mEOS3 से हरी फ्लोरोसेंट के आधार पर फ्लोरोसेंट जांच व्यक्त पहचानें। सुनिश्चित करें कि फ्लोरोसेंट मोती पास भी इस रूप में इमेजिंग के दौरान शामिल किए गए हैं ऑफ़लाइन डीआरआई के लिए बाद में की आवश्यकता है बनाओफुट सुधार। एक संदर्भ छवि के रूप में mEOS3 (हरा) चैनल में कोशिका झिल्ली का एक TIRF छवि को इकट्ठा करने के लिए "कब्जा" बटन पर क्लिक करें। (महत्वपूर्ण कोण तक पहुंचने के बाद, एक और 2 डिग्री बारी) एक उथले क्षणभंगुर लहर उत्तेजना रोशनी का उपयोग करें TIRF कोण लाइव सेल इमेजिंग के लिए सेटिंग में 2120 में टाइप करके। नोट: यह प्लाज्मा झिल्ली को cytosol आसन्न में अपार mEos3-पीएच से प्रतिदीप्ति कम करता है। "आरएफपी चैनल" बटन (561 एनएम उत्तेजना, 600/50 एनएम उत्सर्जन) में स्विच करें। (3.1.4 देखें) "AOTF पैड" में स्क्रॉलबार के साथ 10 ~ 20 सेकंड के लिए झिल्ली चादरों की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति ब्लीच करने के लिए पूरी शक्ति 561 एनएम लेजर का प्रयोग करें। लाल चैनल में "अब भागो" बटन (561 एनएम पूरी शक्ति, "कैमरा" सेटिंग टैब में 10 मिसे / फ्रेम पर सेट) एक साथ 405 एनएम लेजर सक्रियण के साथ क्लिक करके छवि अधिग्रहण शुरू करो। स्थानिक अलग अंक सक्रिय करने के लिए 405 एनएम लेजर तीव्रता को समायोजित करेंप्रत्येक फ्रेम में। नोट: अधिग्रहण आगम, संयुक्त राष्ट्र के परिवर्तित mEOS3.1-पीएच पीएलसी δ1 अणु नंबर धीरे-धीरे कम हो जाती है। धीरे-धीरे एक अणु के संकेत अनुकूलन करने के लिए 405 एनएम लेजर शक्ति में वृद्धि। इमेजिंग अधिग्रहण लंबाई प्रयोगात्मक उद्देश्य पर निर्भर करता है। सामान्य परिस्थितियों में 5 मिनट के लिए लगातार छवियों मोल। एक लंबे समय तक अधिग्रहण की आवश्यकता है, एक एकल, बड़े छवि ढेर के बजाय कई छवि के ढेर इकट्ठा। प्रत्येक छवि के ढेर का फ़ाइल आकार 4 जीबी से अधिक नहीं होनी चाहिए या इसे बाद में सॉफ्टवेयर विश्लेषण को प्रभावित करेगा। 4. SMLM इमेज प्रोसेसिंग और पुनर्निर्माण एक छवि विश्लेषण स्टेशन के लिए छवि फ़ाइलों (.tif छवि के ढेर) हस्तांतरण। के रूप में पहले 37 में वर्णित Matlab में छवि पुनर्निर्माण कार्यक्रम (कस्टम लिखा) लॉन्च और मुख्य मेनू में "फाइल" टैब पर क्लिक करके छवि ढेर लोड, तो "खुला", फिर "नई फ़ाइल"। पहचानें और लोकाप्रत्येक फ्रेम से अलग-अलग घटनाओं में आणविक Lize। "तरंगिका" में एक सीमा संख्या (1-10) के साथ तीव्रता दहलीज को छानने के लिए सेट करें। नेत्रहीन पुनर्निर्माण से पहले बिंदु का पता लगाने के लिए इष्टतम पैरामीटर सेटिंग्स की जाँच करें। तो फिर "पाम" टैब पर जाने के लिए और क्लिक करें "एक कदम प्रक्रिया" छवि पुनर्निर्माण शुरू करने के लिए। नोट: बिंदु का पता लगाने के लिए तीव्रता दहलीज मनमाना है और व्यक्तिगत अनुभव पर निर्भर करता है। कई परीक्षणों के एक इष्टतम पता लगाने की दहलीज उत्पन्न करने के लिए है कि न तो भी कई अयोग्य (मंद) अंक ऊपर उठाता है और न ही बहुत कई योग्य (उज्ज्वल) अंक से बाहर फिल्टर की आवश्यकता हो सकती है। डेटा विश्लेषण अनुकूलन करने के लिए अन्य मानकों को समायोजित करें। इधर, पड़ोस की दूरी (दूरी के भीतर पड़ोसी फ्रेम संयुक्त रहे हैं में प्रतिदीप्ति अंक) 65 एनएम (1/2 पिक्सेल चौड़ाई) के रूप में स्थापित किया है और एक ही अणु के रूप में लगाया जाता है। गैप फ्रेम (व्यक्तिगत अणु घटनाओं है कि इन तख्तों और पड़ोस दूरी के भीतर हुई संयुक्त और एक अणु घटना के रूप में लगाया गया है)PAmCherry1 इमेजिंग 40 के लिए 26 फ्रेम (1.3 सेकंड) के रूप में निर्धारित किया है। एक अणु जांच और अधिग्रहण की दर के गुणों के अनुसार SMLM में 40 से अधिक की गिनती से बचने के लिए इन पैरामीटर समायोजित करें। पुनर्निर्माण के दौरान फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ बहाव सुधार लागू करें। इमेजिंग iRFP-PAmCherry1-पीएच पीएलसी δ1 द्वारा लेबल निश्चित झिल्ली शीट के लिए, एक सुपर संकल्प छवि 37 में एक ही झिल्ली चादर से पूरी छवि के ढेर का पुनर्निर्माण किया। के लिए जीना सेल mEOS3.1-पीएच पीएलसी δ1 द्वारा लेबल नमूने, 1000 फ्रेम के कई छोटे ढेर में पूरे छवि ढेर अलग इसलिए है कि 1000 से लगातार फ्रेम ढेर एक भी सुपर संकल्प छवि, की एक अस्थायी समाधान है जो के रूप में खंगाला है 10 सेकंड। अंत में, अंतिम समय की श्रृंखला ढेर 23 में हर समय श्रृंखला छवियों गठबंधन। नोट: लाइव सेल इमेजिंग पाम में, सक्रिय जांच की एक छोटी संख्या को स्थानांतरित करने या अलग कर देना सकता हैसे पीआई (4,5) विरंजन से पहले प्रधानमंत्री में पी 2। जांच के oversampling के लिए खाते में करने के लिए, छवि विश्लेषण के दौरान एक भी उत्सर्जन घटना में 130 एनएम (65 एनएम के बजाय) के भीतर पड़ोसी फ्रेम में अलग-अलग अणु संकेतों गठबंधन। खंगाला छवियों को प्राप्त करने के बाद, अणु घनत्व, सूक्ष्म डोमेन घनत्व / आकार, और क्लस्टर जोड़ी सहसंबंध 41 के साथ विश्लेषण यों तो Matlab में कस्टम लिखा कार्यक्रम के साथ आगे की छवि विश्लेषण के लिए बाहर ले।

Representative Results

हमारे सुपर संकल्प प्रणाली के स्थानीयकरण अनिश्चितता (σ) 14.73 एनएम 23 है। TIRF और पाम छवियों के बीच प्रत्यक्ष तुलना स्थानिक संकल्प का एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रदर्शन किया। चित्रा 3 ए-बी पीआई (4,5) पी 2 एंटीबॉडी और iRFP-PAmCherry1-पीएच पीएलसी के साथ लेबल प्रतिनिधि पीआई (4,5) पी 2 TIRF छवियों से पता चलता ठेठ झिल्ली चादरें और जीवित कोशिकाओं में δ1। झिल्ली शीट में पारंपरिक TIRF माइक्रोस्कोपी छवियों के साथ उल्लेखनीय बरकरार लाइव बढ़ाया हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ लेबल की कोशिकाओं में उन लोगों के लिए समान हैं (EGFP) टैग की पीएच डोमेन (EGFP-पीएच PLCδ1) (चित्रा 3 सी)। सभी नमूनों जांच का एक भी वितरण दिखाया। इसके विपरीत, नमूनों की गैर इष्टतम निर्धारण तेज घने पीआई (4,5) पी 2 समूहों और संकेत तीव्रता में कमी (चित्रा 4) में हुई। इष्टतम निर्धारण शर्तों के तहत, टीवह पीआई (4,5) तय की कोशिकाओं में पी 2 (चित्रा 5) के सुपर संकल्प छवियों केवल सीमित एकाग्रता ढ़ाल के साथ प्रधानमंत्री का एक महत्वपूर्ण भाग में जांच की एक समरूप वितरण का पता चला। कुछ झिल्ली पैच पीआई (4,5) पी 2 जांच के साथ समृद्ध कम वितरित और विभिन्न आकारों थी। लाइव सेल पाम छवियों तय कोशिकाओं के रूप में एक समान स्थानिक वितरण (चित्रा 6) प्रदर्शित करते हैं। पीआई (4,5) पी स्थानीय क्षेत्रों में तेजी से गतिशीलता में समय परिणामों पर 2 संकेतों का विस्तृत विश्लेषण, व्यापक क्षेत्रों में उनकी बहुतायत के महत्वपूर्ण परिवर्तन के बिना। चित्रा 1. फ्लोरोसेंट इस अध्ययन में इस्तेमाल जांच के लिए योजना। निश्चित झिल्ली पत्र प्रयोगों में इस्तेमाल किया (एबी) iRFP-PAmCherry1-पीएच पीएलसी δ1 जांच। पारंपरिक TIRF इमेजिंग (ए), 640 एनएम के दौरान (:; एम 692 एनएम: 713 एनएम पूर्व) लेजर iRFP उत्तेजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। TIRF छवि को इस हालत में ले लिया पाम इमेजिंग (बी) के द्वारा प्राप्त की सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए एक TIRF संदर्भ छवि के रूप में कार्य करता है। 405 एनएम लेजर करने के लिए प्रयोग किया जाता है PAmCherry1 fluorophore फोटो को सक्रिय करने और एक 561 एनएम लेजर उत्तेजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है PAmCherry1 (पूर्व: 564 एनएम, एम: 595 एनएम) पाम इमेजिंग के लिए। (सीडी) mEos3.1-पीएच PLCδ1 जीवित कोशिका प्रयोगों में इस्तेमाल की जांच। (सी) पारंपरिक TIRF इमेजिंग के दौरान, एक 488 एनएम लेजर उत्तेजित करने के लिए mEOS3.1 (:;: 519 एनएम एम 506 एनएम पूर्व) का इस्तेमाल किया जाता है। (: 573 एनएम, एम: पूर्व 584 एनएम) (डी) एक 405 एनएम लेजर द्वारा photoconversion के बाद, mEos3.1 लाल रूप में बदल जाता है। और एक 561 एनएम लेजर पाम अधिग्रहण के लिए प्रयोग किया जाता है का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा। एस / ftp_upload / 54466 / 54466fig2.jpg "/> चित्रा 2. आईएनएस-1 कोशिकाओं से झिल्ली पत्र तैयार करने के लिए योजना। (ए) एक पीडीएल लेपित coverslip पर नीचे का सामना करना पड़ संवर्धित कोशिकाओं के साथ coverslip रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 ~ 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए PDL- सेल लगाव अनुमति देने के लिए लेपित coverslip। (बी) चिमटी के साथ शीर्ष coverslip छील और झिल्ली पत्र पीडीएल पूर्व लेपित coverslip से जुड़ी तय कर लो। (सी) छवि TIRFM और हथेली के साथ नमूने हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 3. पीआई (4,5) पी 2 स्थानिक संगठन पारंपरिक TIRF खुर्दबीन के नीचे झिल्ली चादरें और बरकरार जीवित कोशिकाओं के बीच इसी तरह की है। (ए) एकझिल्ली चादरों की ठेठ TIRF छवि 4% पीएफए ​​और 0.2% जीए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर तय की। पीआई (4,5) पी 2 पी (4,5) पी 2 विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ चिह्नित किया गया। (बी) आईएनएस-1 सेल iRFP-PAmCherry1-पीएच पीएलसी δ1 व्यक्त करने से एक झिल्ली चादर। विभिन्न स्तरों पर EGFP-पीएच PLCδ1 व्यक्त दो बरकरार जीवित कोशिकाओं के (सी) TIRF छवि। स्केल सलाखों: (ए): 3 माइक्रोन; (बी) और (सी):। 5 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4. पीआई (4,5) पी झिल्ली शीट में 2 स्थानिक संगठन आम निर्धारण की स्थिति के प्रति संवेदनशील है। (ए) झिल्ली शीट अकेले 4% पीएफए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर तयऔर (चित्रा 3 ए के रूप में) पीआई (4,5) पी 2 विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल। (बी) झिल्ली पत्र अकेले पीएफए के साथ आरटी पर तय की और पीआई (4,5) पी 2 विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल। ध्यान दें कि पीआई के घने समूहों (4,5) पी 2 जांच स्पष्ट रूप से दिखाई TIRF माइक्रोस्कोप के तहत, बहुत अधिक भी प्रतिदीप्ति चित्रा 3 ए में दिखाया छवियों के विपरीत हैं। स्केल सलाखों: अटल बिहारी:। 3 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा पीआई के 5. पाम इमेजिंग (4,5) पी 2 जांच के लिए एक आईएनएस-1 सेल PM में उनकी नैनोमीटर पैमाने पर वितरण एक आईएनएस-1 सेल iRFP-PAmCherry1-पीएच व्यक्त करने से एक झिल्ली शीट की iRFP TIRF छवि का पता चलता है। (ए) पीएलसीδ1। (बी) PAmCherry1 संकेत पुनर्निर्माण के आधार पर एक ही क्षेत्र में प्रधानमंत्री की हथेली की छवि इसी। नोट सजातीय पीआई (4,5) पी प्रमुख PM क्षेत्रों और कई पीआई (4,5) पी 2 microdomains में 2 स्थानिक वितरण। (सी) (बी) में बॉक्सिंग क्षेत्र के एक बढ़े हुए दृश्य। तीर कम PM microdomains पीआई (4,5) पी 2 जांच के साथ समृद्ध वितरित संकेत मिलता है। स्केल सलाखों: ए और बी: 3 माइक्रोन, सी: 500 एनएम। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें। चित्रा लाइव आईएनएस-1 कोशिकाओं में 6. पाम इमेजिंग। (ए) एक लाइव आईएनएस-1 सेल में की पीआई (4,5) पी 2 TIRF छवि व्यक्त mEos3.1-पीएच पीएलसीδ1। छवि की तेजी से पाम अधिग्रहण (35 डिग्री सेल्सियस) से पहले ग्रीन चैनल में अधिग्रहण कर लिया था। (बी) के 10 सेकंड के अंतराल पर अनुक्रमिक रहते सेल पाम छवियों। Insets स्थानीय पीआई (4,5) (बी) में अलग अलग समय पर एक ही सीधी रेखा 1 की स्थिति के साथ पी 2 घनत्व और (सी) की तीव्रता प्रोफाइल दिखाने। 10 सेकंड के भीतर अपने बड़े स्थानीय तीव्रता परिवर्तन पर ध्यान दें। (डी) पीआई की औसत तीव्रता परिवर्तन के समय पाठ्यक्रम (4,5) (बी) में बड़े क्षेत्र (box2, 3×3 माइक्रोन) और छोटे हलकों (3, 4, और 5, 500 एनएम व्यास) में पी 2 के दौरान 5 पाम इमेजिंग के मिनट (फ्रेम / 10 सेकंड)। नोट स्थानीय पीआई (4,5) पी 2 जांच के तेजी से उतार-चढ़ाव तीव्रता (वृत्त 3, 4 और 5) व्यापक क्षेत्र (बॉक्स 2) में बहुत छोटे परिवर्तन की तुलना में। (ई) बढ़े पाम संकेत समय पर (बी) में box2 क्षेत्र की छवियों। तीर पीआई (4,5) पी 2 पी समृद्ध झिल्ली के तहत पैच का संकेतhysiological की स्थिति। स्केल सलाखों: सी: 3 माइक्रोन, ई: 500 एनएम। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

Discussion

झिल्ली शीट उत्पादन और नमूना निर्धारण: समस्या निवारण के लिए, दो प्रक्रियाओं के अतिरिक्त ध्यान देने की जरूरत है। प्रोटोकॉल में वर्णित है, कदम 1.1.6 में coverslips के ऊष्मायन समय झिल्ली शीट उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। हमारे प्रयोगात्मक शर्त के तहत इष्टतम ऊष्मायन समय 7-10 मिनट (चित्रा 2) है। 10 मिनट ऊष्मायन की तुलना में अब कम या पीडीएल लेपित coverslips पर कोई झिल्ली शीट को बढ़ावा मिलेगा पीडीएल coverslips और कम ऊष्मायन पर झिल्ली शीट के बजाय बरकरार कोशिकाओं का उत्पादन होगा। प्रोटोकॉल में वर्णित है, नियतन के दौरान fixatives और तापमान पीआई (4,5) प्रधानमंत्री में पी 2 वितरण को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। आरटी पर निर्धारण या अकेले 4% -PFA के उपयोग के प्रधानमंत्री में सामान्य लिपिड वितरण बिगाड़ना सकता है।

लिपिड अनुसंधान झिल्ली को पाम माइक्रोस्कोपी लागू करके, हम पीआई के नैनोमीटर पैमाने पर वितरण का निरीक्षण करने में सक्षम हैं (4,5) पी 2, एक प्रमुख phosphoinositide कि मीटर मध्यस्थताकिसी भी मौलिक सेलुलर गतिविधियों। इस स्थानिक आईएनएस-1 कोशिकाओं में सीमित एकाग्रता ढ़ाल के साथ की पीआई (4,5) पी 2 वितरण लिपिड, प्रोटीन बातचीत और पीआई (4,5) इन कोशिकाओं में पी 2 के स्थानीय संकेत घटनाओं पुनर्विचार के लिए एक रूपरेखा प्रदान करता है। इसके अलावा, इस काम में विकसित तरीकों में भी अन्य झिल्ली फॉस्फोलिपिड अनुसंधान करने के लिए उचित जांच के साथ जैविक प्रक्रियाओं में phosphoinositides का अध्ययन करने के उपन्यास उपकरणों की पेशकश लागू किया जा सकता है, जिससे,।

डिटर्जेंट उपचार और cytosol से संभावित संकेत संदूषण: इस काम में झिल्ली पत्रक के उपयोग फॉस्फोलिपिड रूपात्मक अध्ययन में दो प्रमुख चिंताओं को नजरअंदाज। डिटर्जेंट अक्सर क्लस्टरिंग और प्रधानमंत्री फॉस्फोलिपिड संकेत के महत्वपूर्ण नुकसान का कारण। साइटोसोलिक संकेत के प्रदूषण को इस तरह के पीआई (3,4,5) पी 3 और पीआई (3,4) पी 2 के रूप में प्रधानमंत्री 23 पर कम बहुतायत phosphoinositides के मामले में विशेष रूप से समस्याग्रस्त है। झिल्ली पत्र के नमूने circu करने में सक्षम हैंकाफी ऐसे cortical actin meshwork और क्लैथ्रिन लेपित गड्ढ़े 42,43 के रूप में प्लाज्मा झिल्ली के साथ जुड़े संरचनाओं, बाधा पहुँचा के बिना इन समस्याओं mvent। प्रधानमंत्री के पीआई (4,5) पी 2 रिश्तेदार समरूप वितरण अन्य जल्दी ठंड ईएम fibroblast झिल्ली 44 में जीएसटी पीएच पीएलसी δ1 जांच का उपयोग पढ़ाई के साथ अच्छे समझौते में है।

यह नोट करना अनुचित नमूना प्रसंस्करण की स्थिति भ्रामक परिणाम उत्पन्न कर सकते हैं कि महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, यह एक कम तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) पर निर्धारण चरणों का प्रदर्शन और झिल्ली शीट उत्पादन के लिए लगानेवाला जीए का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। के रूप में 3 चित्र में दिखाया, गर्म तापमान और पीएफए निर्धारण जीए बिना सेल PM में phosphoinositides ठीक करने के लिए पर्याप्त नहीं है। यह बरकरार पीआई (4,5) पी 2 वितरण बिगाड़ना और तेज समूहों कि जीवित कोशिकाओं में शारीरिक शर्तों के तहत नहीं मनाया जाता है उत्पन्न कर सकता है। दूसरा, PAmCherry1 के उपयोग के रूप मेंSMLM जांच, बल्कि अन्य जांच की तुलना में, मात्रात्मक पाम इमेजिंग के लिए निर्णायक है। PAmCherry1 आवेदन के लाभ के इस तरह चमक, उच्च फोटो सक्रियण दक्षता और सभी के अधिकांश, बहुत सीमित तस्वीर-निमिष के रूप में अपनी अच्छी तरह से विशेषता एकल आणविक तस्वीर-भौतिक गुणों 35,40,45, से आता है। इन गुणों तस्वीर-निमिष से संभावित क्लस्टर कलाकृतियों को खत्म करने और मात्रात्मक झिल्ली पीआई (4,5) पी 2 की आणविक घनत्व का विश्लेषण करने के लिए सक्षम करें।

यह दृष्टिकोण भी अपनी सीमाएं हैं। सबसे पहले, झिल्ली पत्र इस अध्ययन में इस्तेमाल विधि पूरी तरह से पीआई (4,5) पी 2 शारीरिक वितरण क्योंकि सेल इमेजिंग से पहले बाधित है की नकल नहीं कर सकते। हालांकि, हमारे जीने पाम इमेजिंग, के पीआई (4,5) पी 2 समान अपेक्षाकृत सजातीय वितरण से पता चलता झिल्ली पत्र के नमूनों के साथ मनाया परिणामों का समर्थन। दूसरा, के रूप में हम हमारे पिछले काम 23 में चर्चा की, SMLM इमेजिंग विशेषज्ञता और अतिरिक्त आवश्यकता परtention इमेजिंग कलाकृतियों कि प्रयोग किया जाता जांच, नमूना तैयार करने और निर्धारण, छवि नमूना और पुनर्निर्माण सहित विभिन्न प्रक्रियाओं, से पैदा हो सकता है से बचने के लिए। अन्त में, हालांकि पीएच डोमेन आधारित जांच और एंटीबॉडी व्यापक रूप से phosphoinositide अध्ययनों 46,47 में इस्तेमाल किया गया है कि यह संभव नहीं है कि सभी रहता है पीआई (4,5) झिल्ली में पी 2 इस दृष्टिकोण से पता लगाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पीआई (4,5) पी 2 अन्य अंतर्जात प्रोटीन से बंधे पीएच जांच या एंटीबॉडी के लिए सुलभ नहीं हो सकता है, और यह खुद को जांच के अंतरिक्ष बाधा के कारण पीआई (4,5) पी 2 के एक मूल्यवान समझना के कारण हो सकता है। लेबलिंग पीआई (4,5) पी 2 का एक वैकल्पिक तरीका मूल की पूंछ पर एक संशोधन के साथ उपयोग किया जाएगा शीर्ष-स्त्राव पीआई (4,5) पी 2 48, एक पूर्व लेबल पीआई (4,5) पी 2 एनालॉग पीआई (4,5) पी 2। हालांकि, यह तेजी से जीवित कोशिका चयापचय द्वारा अन्य phosphoinositide उपप्रकारों में तेजी से परिवर्तित किया जा सकता है, क्योंकि इसकी inositol अंगूठी endogenou रूप में ही हैएस पीआई (4,5) पी 2। यह चिंता का विषय है कि क्या जीवित कोशिकाओं में इस पूर्व लेबल पीआई (4,5) पी 2 अनुरूप ईमानदारी से प्रतिनिधित्व कर सकते हैं पीआई (4,5) पी 2 के बजाय अपने चयापचय उत्पादों को उठाती है। इसलिए, कुछ सीमाओं के बावजूद, पीएच डोमेन आधारित जांच अभी भी सबसे अच्छा है कि व्यापक रूप से जांच पीआई (4,5) पी 2 वितरण और पर कोशिकाओं के प्रधानमंत्री गतिशीलता की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया गया शामिल हैं।

इस पद्धति के भविष्य के आवेदन ऐसे पीआई (3,4,5) पी 3 और पीआई (3,4) पी 2 के रूप में अन्य phosphoinositide अध्ययन, के लिए बढ़ाया जा सकता है। सारांश में, उपन्यास SMLM यहां इस्तेमाल किया दृष्टिकोण कोशिकाओं में phosphoinositide अध्ययन करने के लिए नए तरीके खोलता है। एक उदाहरण के रूप पीआई (4,5) पी 2 का उपयोग करना, हम कोशिका झिल्ली के अणुओं की रूपात्मक और मात्रात्मक अध्ययन में पाम इमेजिंग का अद्वितीय गुण, साथ ही अपनी कमियां प्रदर्शित करता है। इस दृष्टिकोण के हितों के अन्य अणुओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और कोशिका जीव विज्ञान में व्यापक आवेदन करना होगा।

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).

Materials

Microscope Nikon Ti-U
sCMOS camera Andor Neo
Spinning disk Yokogawa CSU X-1, 10,000 rpm 
 High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. Agilent MLC400 laser original powers & powers at the end of optical fiber)
405nm: 15 mW & 13 mW;
488nm: 45 mW & 42 mW;
561nm: 45 mW & 40 mW;
640nm: 35 mW & 16 mW.
100X Objective Nikon APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm 
Nikon acquisition and analysis software(NIS Element) Nikon
Matlab MathWorks
Coverslip Warner 64-0714 Round 18mm coverslip, #1.5 
Fibronectin Millipore FC010-5MG
Lipofectamin 3000(transfection reagent) Invitrogen L3000-008
Glutaraldehyde Electron Microscopy Science #16120
PI(4,5)P2 1st antibody Santa Cruz sc-53412
secondary antibody  F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21237
Tetraspeck beads Invitrogen T7279
magnetic quick release imaging chamber  Warner Instruments Cat#641994
temperature controller Warner Instruments TC-344C
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Phosphate buffer saline Sigma P4417-100TAB
EGTA Sigma 3780
NH4Cl Sigma A0171
Goat serum Sigma G9023
bovine serum albumin Sigma A7906
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
CaCl2*2H2O Sigma 223506
MgCl2*6H2O Sigma M9272
Glucose Sigma G7021
HEPES Sigma H4034
Paraformaldyhyde Sigma P6148
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443, 651-657 (2006).
  2. Hammond, G. R. V., et al. PI4P And PI(4,5)P(2) Are Essential But Independent Lipid Determinants Of Membrane Identity. Science. 337, 727-730 (2012).
  3. Nakatsu, F., et al. PtdIns4P synthesis by PI4KIIIalpha at the plasma membrane and its impact on plasma membrane identity. J Cell Biol. 199, 1003-1016 (2012).
  4. Cantley, L. C. The phosphoinositide 3-kinase pathway. Science. 296, 1655-1657 (2002).
  5. Czech, M. P. Dynamics of phosphoinositides in membrane retrieval and insertion. Annu Rev Physiol. 65, 791-815 (2003).
  6. Spira, F., et al. Patchwork organization of the yeast plasma membrane into numerous coexisting domains. Nat Cell Biol. 14, 640-648 (2012).
  7. Barg, S., Knowles, M. K., Chen, X., Midorikawa, M., Almers, W. Syntaxin clusters assemble reversibly at sites of secretory granules in live cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20804-20809 (2010).
  8. Sieber, J. J., et al. Anatomy and dynamics of a supramolecular membrane protein cluster. Science. 317, 1072-1076 (2007).
  9. Knowles, M. K., et al. Single secretory granules of live cells recruit syntaxin-1 and synaptosomal associated protein 25 (SNAP-25) in large copy numbers. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 20810-20815 (2010).
  10. Milosevic, I., et al. Plasmalemmal phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate level regulates the releasable vesicle pool size in chromaffin cells. J Neurosci. 25, 2557-2565 (2005).
  11. van Rheenen, J., Jalink, K. Agonist-induced PIP(2) hydrolysis inhibits cortical actin dynamics: regulation at a global but not at a micrometer scale. Mol Biol Cell. 13 (2), 3257-3267 (2002).
  12. Hammond, G., Schiavo, G., Irvine, R. Immunocytochemical techniques reveal multiple, distinct cellular pools of PtdIns4P and PtdIns (4, 5) P2. Biochem J. 422, 23-35 (2009).
  13. Huang, S., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate-rich plasma membrane patches organize active zones of endocytosis and ruffling in cultured adipocytes. Mol Cell Biol. 24, 9102-9123 (2004).
  14. James, D. J., Khodthong, C., Kowalchyk, J. A., Martin, T. F. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate regulates SNARE-dependent membrane fusion. J Cell Biol. 182, 355-366 (2008).
  15. Laux, T., et al. GAP43, MARCKS, CAP23 modulate PI(4,5)P(2) at plasmalemmal rafts, and regulate cell cortex actin dynamics through a common mechanism. J Cell Biol. 149, 1455-1472 (2000).
  16. Aoyagi, K., et al. The activation of exocytotic sites by the formation of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate microdomains at syntaxin clusters. J Biol Chem. 280, 17346-17352 (2005).
  17. Kabachinski, G., Yamaga, M., Kielar-Grevstad, D. M., Bruinsma, S., Martin, T. F. CAPS and Munc13 utilize distinct PIP2-linked mechanisms to promote vesicle exocytosis. Mol Biol Cell. 25, 508-521 (2014).
  18. Wang, J., Richards, D. A. Segregation of PIP2 and PIP3 into distinct nanoscale regions within the plasma membrane. Biol Open. 1, 857-862 (2012).
  19. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19, 780-782 (1994).
  20. van den Bogaart, G., et al. Membrane protein sequestering by ionic protein-lipid interactions. Nature. 479, 552-555 (2011).
  21. van Rheenen, J., Achame, E. M., Janssen, H., Calafat, J., Jalink, K. PIP2 signaling in lipid domains: a critical re-evaluation. Embo J. 24, 1664-1673 (2005).
  22. Sato, K., et al. Differential requirements for clathrin in receptor-mediated endocytosis and maintenance of synaptic vesicle pools. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1139-1144 (2009).
  23. Ji, C., Zhang, Y., Xu, P., Xu, T., Lou, X. Nanoscale Landscape of Phosphoinositides Revealed by Specific Pleckstrin Homology (PH) Domains Using Single-molecule Superresolution Imaging in the Plasma Membrane. J of Biol Chem. 290, 26978-26993 (2015).
  24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  27. Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339, 452-456 (2013).
  28. Wombacher, R., et al. Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates. Nat Methods. 7, 717-719 (2010).
  29. Szymborska, A., et al. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  30. Pertsinidis, A., et al. Ultrahigh-resolution imaging reveals formation of neuronal SNARE/Munc18 complexes in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 2812-2820 (2013).
  31. Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proc Natl Acad Sci. 109, 13978-13983 (2012).
  32. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  33. Balla, T., Várnai, P. Visualization of Cellular Phosphoinositide Pools with GFP-Fused Protein-Domains. Curr Protoc Cell Biol. 24, 24 (2009).
  34. Xu, C., Watras, J., Loew, L. M. Kinetic analysis of receptor-activated phosphoinositide turnover. J Cell Biol. 161, 779-791 (2003).
  35. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods. 6, 153-159 (2009).
  36. Filonov, G. S., et al. Bright and stable near infra-red fluorescent protein for in vivo imaging. Nature Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
  37. Zhang, M., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nat Methods. 9, 727-729 (2012).
  38. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  39. Dyachok, O., Isakov, Y., Sågetorp, J., Tengholm, A. Oscillations of cyclic AMP in hormone-stimulated insulin-secreting β-cells. Nature. 439, 349-352 (2006).
  40. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 18519-18524 (2013).
  41. Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
  42. Morone, N., et al. Three-dimensional reconstruction of the membrane skeleton at the plasma membrane interface by electron tomography. J Cell Biol. 174, 851-862 (2006).
  43. Peters, K. R., Carley, W. W., Palade, G. E. Endothelial plasmalemmal vesicles have a characteristic striped bipolar surface structure. J Cell Biol. 101, 2233-2238 (1985).
  44. Fujita, A., Cheng, J., Tauchi-Sato, K., Takenawa, T., Fujimoto, T. A distinct pool of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in caveolae revealed by a nanoscale labeling technique. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9256-9261 (2009).
  45. Durisic, N., Laparra-Cuervo, L., Sandoval-Álvarez, &. #. 1. 9. 3. ;., Borbely, J. S., Lakadamyali, M. Single-molecule evaluation of fluorescent protein photoactivation efficiency using an in vivo nanotemplate. Nat Methods. 11, 156-162 (2014).
  46. Thomas, C. L., Steel, J., Prestwich, G. D., Schiavo, G. Generation of phosphatidylinositol-specific antibodies and their characterization. Biochem Soc Trans. 27, 648-652 (1999).
  47. Várnai, P., Balla, T. Live cell imaging of phosphoinositides with expressed inositide binding protein domains. Methods. 46, 167-176 (2008).
  48. Honigmann, A., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate clusters act as molecular beacons for vesicle recruitment. Nature Struct Mol Biol. 20, 679-686 (2013).

Tags

Keywords: Single-molecule Super-resolution ImagingPhosphatidylinositol 45-bisphosphatePlasma MembraneFluorescent ProbesNanoscale DistributionPhosphoinositide SignalingHigh Spatial ResolutionDetergent-freePlasma Membrane Sheet PreparationPhosphoinositide LabelingSingle-molecule Fluorescence ImagingSingle-molecule LocalizationTIRF MicroscopySMLM
check_url/fr/54466?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Ji, C., Lou, X. Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes. J. Vis. Exp. (116), e54466, doi:10.3791/54466 (2016).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image