Novel protéines __gVirt_NP_NN_NNPS<__ ARN-Binding Isolation par la méthodologie RaPID

Résumé

Les interactions ARN-protéine sont au cœur de nombreux processus cellulaires. Ici, nous décrivons une méthode in vivo pour isoler un ARN spécifique et identifier de nouvelles protéines qui lui sont associées. Cela pourrait jeter un nouvel éclairage sur la façon dont les ARN sont régulés dans la cellule.

Résumé

Les protéines de liaison à l’ARN (RBP) jouent un rôle important dans tous les aspects du métabolisme et de la régulation de l’ARN. Leur identification est un défi majeur de la biologie moderne. Seules quelques méthodes in vitro et in vivo permettent d’identifier des RBP associées à un ARNm cible particulier. Cependant, leurs principales limites sont l’identification des RBP dans un environnement non cellulaire (in vitro) ou l’isolement à faible efficacité de l’ARN d’intérêt (in vivo). Une méthodologie de purification et d’identification des protéines de liaison à l’ARN (RaPID) a été conçue pour surmonter ces limitations chez la levure et permettre l’isolement efficace des protéines associées in vivo. Pour ce faire, l’ARN d’intérêt est marqué avec des boucles MS2 et co-exprimé avec une protéine de fusion d’une protéine de liaison à MS2 et d’une protéine de liaison à la streptavidine (SBP). Les cellules sont ensuite soumises à la réticulation et lysées, et les complexes sont isolés par des billes de streptavidine. Les protéines qui co-purifient avec l’ARN marqué peuvent ensuite être déterminées par spectrométrie de masse. Nous avons récemment utilisé ce protocole pour identifier de nouvelles protéines associées à l’ARNm PMP1 associé au RE. Ici, nous fournissons un protocole détaillé de RaPID et discutons de certaines de ses limites et avantages.

Introduction

Protéines liant l'ARN (RBP) représentent environ 10% de S. protéines cerevisiae ^1,2 et environ 15% de protéines de mammifères ^3-5. Ils sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que le traitement de l'ARNm post-transcriptionnelle et de régulation, la traduction, la biogenèse des ribosomes, ARNt aminoacylation et modification, remodelage de la chromatine, et plus encore. Un sous - groupe important de la RBP est les protéines d'ARNm de liaison (mRNP) ^6,7. Au cours de l' ARNm maturation, différentes RBP lient la transcription et la médiation de son traitement nucléaire, l' exportation....

Protocole

Remarque: Insérez une séquence composée de 12 MS2 sites de liaison (boucles MS2; MS2L) dans le locus génomique désiré, habituellement entre le cadre de lecture ouvert (ORF) et 3 'UTR. Un protocole détaillé pour cette intégration est prévue ailleurs ^22. Vérifier une insertion correcte et à l' expression par PCR, analyse de Northern ou par RT-PCR ^20,23. Il est important de vérifier que l'intégration ne sont pas intervenus avec la synthèse du 3'UTR. En outre, un MS2-CP plasmide exprimant fusionné à SBP sous l'expression d'un promoteur inductible (depletion de methionine) devrait également être introduit dans les cellules

Résultats

RaPID permet l'isolement d'un ARN cible spécifique avec ses protéines associées. Critique pour son succès est de garder l'ARN intact, autant que possible, de façon à obtenir une quantité suffisante de protéines. Pour déterminer l'efficacité de l' isolement et de la qualité de l' ARN, on effectue une analyse de Northern (figure 1A). analyse Northern a l'avantage de rendre compte directement l'efficacité et la qualité des RaPID. Ainsi, les q.......

Discussion

Diverses méthodes utilisent l'isolement des ARNm spécifiques pour identifier leurs protéines associées ^{11,34 35.} Ces méthodes sont applicables in vitro et in vivo des stratégies pour sonder les interactions ARN-protéine. Incuber les méthodes in vitro avec l' ARN transcrit de manière exogène lysat cellulaire pour capturer RBP et isoler les complexes RNP ^36,37. Une approche efficace de ce type a été présenté récemment, ce qui a permis l'identification.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tris	sigma	T1503
SDS	bio-lab	1981232300
DTT	sigma	D9779
Phénol acide (pH 4,3)	sigma	P4682
Phénol acide : Chloroforme (5:1, pH 4,3)	sigma	P1944
Chloroforme	bio-lab	3080521
Formaldéhyde	Frutarom	5551820
Glycine	sigma	G7126
NP-40	Calbiochem	492016
Héparine	Sigma	H3393
Phénylméthylsulfonyl Flouride (PMSF)	Sigma	P7626
Leupeptin	Sigma	L2884
Aprotinine	Sigma	A1153
Inhibiteur de la trypsine de soja	Sigma	T9003
Pepstatine	Sigma	P5318
DNase I	Promega	M610A
ribonucléase  ; Inhibiteur	Takara	2313A
Perles de verre	Sartorius	BBI-8541701	0,4-0,6mm de diamètre  ;
Mini BeadBeater	BioSpec	Mini BeadBeater 16
Guanidinium	Sigma	G4505
Avidin	Sigma	A9275
Perles de streptavidine	GE Healthcare  ;	17-5113-01
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma	A7906
ARNt de levure	Sigma	R8508
Biotine	Sigma	B4501
Extrait de levure	Bacto	288620
peptone	Bacto	211677
Glucose	Sigma	G8270
1x Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
0,2 M NaOH
4x Laemmli Sample Buffer (LSB)			0,2 M Tris-HCL pH 6,8, 8 % SDS, 0,4 M DTT, 40 % glycérol, 0,04 % Bromophenol-Blue.
Tampon de lyse			10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5 % SDS  ;
3 M Acétate de sodium pH 5,2
100 % et 70 % d’éthanol (EtOH)
RNeau
rase Tampon			20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,8 mM MgCl2, 0,5 % NP-40, 5 mg/ml d’héparine, 1 mM de dithiothréitol (DTT), 1 mM de phénylméthylsulfonyl fluorure (PMSF), 10 & micro ; g/ml de leupeptine, 10 & micro ; g/ml d’aprotinine, 10 & micro ; g/ml Inhibiteur de la trypsine de soja, 10 & micro ; g/ml de pepstatine, 20 U/ml de DNase I, 100 U/ml de ribonucléase. Inhibiteur.
		d’inversion de réticulation	100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.
		de lavage RaPID	20 mM Tris-HCl pH 7,5,  ; 300 mM NaCl, 0,5 % NP-40
0,5 M EDTA pH 8
Silver Stain Plus Kit	Bio-Rad  ;	161-0449	Pour la détection de protéines dans les gels de polyacrylamide
milieu sélectif SD			1,7 g/l Base azotée de levure sans acides aminés et sulfate d’ammonium, 5 g/l Sulfate d’ammonium, 2 % de glucose, 350 mg/l Thréonine, 40 mg/l Méthionine, 40 mg/l Adénine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophane, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine
Anti-eEF3 (EF3A, YEF3)	Cadeau de Kinzy TG. (École de médecine Robert Wood Johnson de l’UMDNJ)	1:5 000
Anticorps anti GFP	Santa Cruz	sc-8334	1:3 000
Anti lapin IgG-HRP conjugué	SIGMA	A9169	1:10 000

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