"Fagosom Lukning Assay" til Visualiser fagosom Formation i tre dimensioner Brug total intern refleksion Fluorescent Microscopy (TIRFM)
Summary
We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.
Abstract
Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation.
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.
Introduction
Fagocytose er en stor celle funktion, der starter med genkendelsen og bindingen af materiale til overfladereceptorer, som derefter fører til internalisering og nedbrydning af den indtagne materiale. Mens encellede eukaryoter såsom formen Dictyostelium discoideum og amøber bruger fagocytose til fodring på bakterier, har højere organismer udviklet sig med professionelle celler. Makrofager eller dendritiske celler er den første linje i forsvaret mod patogener i forskellige væv og organer, og er afgørende for at aktivere det adaptive immunsystem gennem antigen præsentation og cytokinproduktion 1-4. Under visse omstændigheder fagocytose kan udføres af ikke-professionelle fagocytiske celler, fx, endotel- og epitelceller. Denne proces er vigtigt at opretholde homeostase under udvikling og i voksenalderen for normalt væv omsætning og remodeling. Endelig specialiserede fagocytter såsom Sertoli celler i testiklerne eller retinalpigment epitelceller er ekstremt potente fagocytter 5.
Dannelsen af en fagosomet hvor nedbrydning af mikroorganismer eller cellulært debris sker starter med gruppering af fagocytiske receptorer på overfladen af den fagocytiske celle. Downstream signalering begivenheder efter gruppering af opsoniske receptorer, såsom Fc-receptorer (FcR) eller supplerer receptorer (CRS) er blevet godt karakteriseret. Men der er også mange ikke-opsoniske receptorer, herunder Toll-lignende receptorer (TLRs), lectiner, mannose receptorer og scavenger-receptorer. Disse receptorer genkender determinanter på partikeloverfladen såsom mannose eller fucoserester, phosphatidylserin og lipopolysaccharider 1,6-9.
Patogen eller celledebris genkendelse involverer binding til og gruppering af flere typer af fagocyterende receptor, som derefter fører til intense og forbigående actin remodeling. Sideløbende omdrejningspunkt exocytose af intracellulær compartts bidrager til frigivelsen af membranspændingen og er vigtig for effektiv fagocytose af store partikler. De signaler, der fører til actin polymerisering og membran deformation blev dissekeret i forsøgsmodeller, der udløste en enkelt fagocytisk receptor. Under FcR-medieret fagocytose, der er intens actin polymerisering, der er reguleret af små GTPaser (Rac, Cdc42). Blandt deres nedstrømseffektorer, den Wiskott-Aldrich syndrom protein (WASP) fører til aktivering af actinrelaterede Protein 2/3 kompleks (ARP2 / 3), der nukleerer actinfilamenter 1,2,4,10. Lokal produktion af phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphat (PI (4,5) P2) er afgørende for indledende actinpolymerisation som driver pseudopod formation. Dets omdannelse til PI (3,4,5) P 3 er nødvendig for pseudopod udvidelse og fagosom lukning 11. Flere veje bidrager til forsvinden af PI (4,5) P2. For det første udstationering af phosphatidylinositol fosfat kinases (PIPKIs) fra fagosomet anholdelser PI (4,5) P2 syntese. For det andet kan det phosphoryleres og forbruges af klasse I PI3K kinaser (PI3K) og konverteres i PI (3,4,5) P 3 12. En rolle for phosphataser og phospholipaser er også blevet antydet i PI (4,5) P2 hydrolyse og F-actin fjernelse under fagocytose i mammale celler og i Dictyostelium 13,14. Phospholipasen C (PLC) δ hydrolyserer PI (4,5) P2 ind diacylglycerol og inositol-1,4,5- tris phosphat. PI (4,5) P2 og PI (3,4,5) P3 phosphatase OCRL (oculocerebrorenal syndrom af Lowe) har også været impliceret i fagosom formation. Præcis lokal dannelse af F-actin og dens depolymerisering er stramt reguleret i rum og tid, og vi har vist, at rekrutteringen af intracellulære rum er vigtigt at levere lokalt på OCRL fosfatase, hvilket bidrager til lokal actin depolymerisering i bunden af den fagocytiske kop <sup> 13,15. Til dette brugte vi den eksperimentelle opsætning beskrevet her.
Mekanismen og molekylære spillere er påkrævet fagosom lukning og membran opdeling forbliver dårligt defineret på grund af vanskelighederne ved at visualisere og overvåge det sted fagosom lukning. Indtil for nylig var fagocytose observeret på faste eller levende celler, der internaliserer partikler på deres dorsale ansigt eller på deres sider, hvilket gør rettidig visualisering af det sted fagosom lukning vanskelig. Desuden kunne fastgørelsesmetoder forårsage tilbagetrækning af membraner og prioritere resultaterne på pseudopodia udvidelse og lukning. Derimod analysen, at vi har sat op og beskrive her giver os mulighed for at visualisere pseudopod udvidelse og lukning trin i fagocytose i levende celler 13, baseret på total intern refleksion mikroskopi (TIRFM) 16. Denne optiske teknik anvender en kortvarig bølge til at excitere fluoroforer i en tynd område ved grænsefladen mellem et transparent sålåg (dækglas), og en væske (celledyrkningsmedium). Tykkelsen af excitation dybde er omkring 100 nm fra den faste overflade, hvilket tillader visualisering af molekylære begivenheder tæt på plasmamembranen. TIRFM tillader et højt signal-til-baggrund-forhold, og begrænser ud af fokus fluorescens opsamlet, og cytotoksicitet skyldes belysning af celler.
Ved at udnytte TIRFM udviklede vi "fagosom lukning assay", hvor dækglas aktiveres med poly-lysin og derefter overtrukket med IgG-opsoniseret røde blodlegemer (IgG-SRBC'er). Makrofager udtrykker transient fluorescens mærkede proteiner af interesse får derefter lov at opsluge IgG-SRBC'er. Mens cellerne løsnes målpartiklerne som er ikke-kovalent bundet til glasoverfladen, kan spidserne af pseudopodier og registreres i TIRF tilstand. opkøb TIRF kombineres med opkøb i epifluorescens tilstand, efter skift etapen 3 um ovenfor, som gør det muligt visualization af bunden af den fagocytiske kop. Tilsætning af farmakologiske lægemidler, såsom dem, inhiberende actin eller dynamin under processen er også muligt yderligere at dissekere processen på det molekylære niveau.
Fremgangsmåden beskrevet i detaljer her protokol er for en RAW264.7 murin makrofag cellelinie og opsoniseret partikler, men praktisk talt, kan den tilpasses til enhver anden fagocytisk celle og med andre mål, såsom perler. Denne metode vil muliggøre bedre karakterisering af forordningen i tid og rum af de molekylære aktører i pseudopod udvidelse og fagosom lukning under forskellige fagocytiske processer.
Protocol
Representative Results
Discussion
The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 °C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nadège Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales” (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.
Materials
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100x, NA1.49.), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10×500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37°C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4°C before use |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. . Encyclopedia of Cell Biology. 2, 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
