"Assay סגירת Phagosome" לדמיין גיבוש Phagosome בשלושה ממדים באמצעות סך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)
Summary
We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.
Abstract
Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation.
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.
Introduction
Phagocytosis היא פונקצית תאים עיקרית שמתחילה עם ההכרה ומחייבת של חומר על פני שטח קולטנים, אשר לאחר מכן מוביל ההפנמה השפל של חומר הבליעה. בעוד אאוקריוטים חד תאיים כגון discoideum Dictyostelium עובש אמבות להשתמש phagocytosis האכלה על חיידקים, יצורים עילאיים התפתחו עם תאים מקצועיים. המקרופאגים או תאים דנדריטים הם קו ההגנה הראשון נגד פתוגנים שונים רקמות ואיברים, והם חיוניים להפעיל את המערכת החיסונית אדפטיבית דרך הייצור מצגת אנטיגן ציטוקינים 1-4. בנסיבות מסוימות phagocytosis יכולה להתבצע על ידי תאי phagocytic הלא מקצועיים, למשל, אנדותל ותאי אפיתל. תהליך זה חשוב לשמור על הומאוסטזיס במהלך פיתוח בבגרות עבור מחזור שיפוץ רקמות בריאות. לבסוף, פגוציטים מיוחדים כגון תאי Sertoli ב testis או ברשתיתתאי אפיתל הפיגמנט הם פגוציטים חזקים מאוד 5.
היווצרות של phagosome שבו השפלה של מיקרואורגניזמים או פסולת הסלולר מתרחשת מתחיל עם אשכולות של קולטנים phagocytic על פני השטח של התא phagocytic. אירועים Downstream איתות הבאים אשכולות של קולטנים opsonic כגון קולטנים Fc (FCR) או קולטני משלימים (CRS) כבר מאופיין היטב. עם זאת, ישנם גם רבים קולטנים שאינם opsonic כולל קולטנים דמוי אגרה (TLRs), לקטינים, קולטנים מנוז ואת הקולטנים נבלות. קולטנים אלה מכירים הקובעים על פני החלקיקים כגון שאריות מנוז או פוקוז, phosphatidylserine, ו lipopolysaccharides 1,6-9.
פתוגן או תא פסול הכרה כרוכה קשירה באשכולות של כמה סוגים של קולטן phagocytic, אשר לאחר מכן להוביל שיפוץ יקטין אינטנסיבי וחולף. בשנת exocytosis במקביל, המוקד של תאיים תאייםts תורמת לשחרור מתח הממברנה חשוב phagocytosis יעיל של חלקיקים גדולים. אירועי האיתות המובילים דפורמציה פילמור הקרום תקטין נותחו במודלים ניסיוניים שהפעילו קולטן phagocytic יחיד. במהלך phagocytosis FCR בתיווך, יש פילמור אקטין אינטנסיבי כי מוסדרת GTPases קטן (RAC, Cdc42). בין effectors הזרם שלהם, חלבון התסמונת ויסקוט-אולדריץ '(WASP) מוביל ההפעלה של החלבון-קשור יקטין 2/3 מורכבים (Arp2 / 3) כי nucleates סיבי יקטין 1,2,4,10. הייצור המקומי של phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate (PI (4,5) P 2) הוא חיוני עבור פילמור אקטין הראשוני שמניע היווצרות מדומות. המרה PI (3,4,5) P 3 נדרשה להארכת מדומות ו phagosome סגר 11. מסלולים כמה לתרום היעלמות PI (4,5) P 2. ניתוק הראשי של קינת פוספט phosphatidylinositolSES (PIPKIs) מן PI מעצרים phagosome (4,5) P 2 סינתזה. שנית, זה יכול להיות פוספורילציה ויאכל על פי מעמד ואני PI3K קינאזות (PI3K) והמיר ב PI (3,4,5) P 3 12. תפקיד phosphatases ו phospholipases גם כבר גלום במסחר PI (4,5) הידרוליזה P 2 והסרת F- יקטין במהלך phagocytosis בתאי יונקים וב Dictyostelium 13,14. ה- C פוספוליפאז (PLC) δ hydrolyzes PI (4,5) P 2 לתוך diacylglycerol ופוספט טריס 1,4,5–אינוזיטול. לצרכן (4,5) P 2 ו PI (3,4,5) OCRL phosphatase P 3 (תסמונת oculocerebrorenal של Lowe) גם היה מעורב היווצרות phagosome. היווצרות מקומית מדויקת של F-תקטין depolymerization החברה מוסדרת היטב במרחב ובזמן ואנחנו הראינו גיוס של תאים תאיים חשוב לספק מקומי phosphatase OCRL, ובכך לתרום depolymerization יקטין המקומי בבסיס כוס phagocytic <sup> 13,15. לשם כך, השתמשנו הגדרת הניסוי המתוארת כאן.
שחקני המנגנון ומולקולריים הנדרשים לסגירת phagosome ו scission הקרום להישאר מוגדרים היטב בגלל קשיי הדמית ניטור באתר של סגירת phagosome. עד לאחרונה, phagocytosis נצפתה על תאים קבוע או לחיות להפנים חלקיקים על פני הגב שלהם או על צדם, מה שהופך את ויזואליזציה בזמן של האתר של סגירת phagosome קשה. בנוסף, שיטות קיבוע יכולות לגרום הכחשה של ממברנות להטות את התוצאות על רחבת pseudopodia וסגירה. לעומת זאת, assay כי הקמנו ולתאר כאן מאפשר לנו לדמיין רחבה מדומות וצעד סגירת phagocytosis בתאים חיים 13, המבוסס על מיקרוסקופיה החזרה הגמורה (TIRFM) 16. טכניקה אופטית זו משתמשת גל חולף לרגש fluorophores באזור דק על הממשק בין שקוף כךהמכסה (coverslip) ו- (תרבית תאים בינוניים) נוזלי. העובי של עומק העירור הוא סביב 100 ננומטר מן המשטח המוצק, המאפשר הדמיה של אירועים מולקולריים קרובים קרום הפלזמה. TIRFM מאפשר יחס אות רקע גבוה, ומגביל את הקרינה מחוץ פוקוס שנאספו ואת cytotoxicity בשל התאורה של תאים.
ניצול של TIRFM, פיתחנו את "assay סגירת phagosome" שבה coverslips מופעלים עם ליזין פולי ומצופה אז עם כדוריות דם אדומות-opsonized IgG (IgG-SRBCs). המקרופאגים להביע חלבונים מתויגים fluorescently הזמני של עניין מותרים אז לבלוע את IgG-SRBCs. בעוד תאים לנתק את חלקיקי היעד המאוגדים הלא קוולנטית אל משטח זכוכית, קצות pseudopods ניתן להבחין והקליט במצב TIRF. רכישות TIRF משולבים עם רכישות במצב epifluorescence, לאחר העברת מיקרומטר בשלב 3 לעיל, המאפשר מולualization של בסיס ספל phagocytic. תוספת של תרופות תרופתיות כגון אלה עיכוב תקטין או dynamin במהלך התהליך אפשרית גם לנתח עוד את התהליך ברמה המולקולרית.
הפרוטוקול המתואר בפירוט כאן הוא עבור קו תא מקרופאג murine RAW264.7 וחלקיקי opsonized, אבל כמעט, זה יכול להיות מותאם לכל תא phagocytic אחר ועם מטרות אחרות כגון חרוזים. שיטה זו תאפשר אפיון טוב יותר של הרגולציה בזמן ובמרחב של השחקנים המולקולריים המעורבים רחבים מדומות וסגירת phagosome במהלך תהליכי phagocytic שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 °C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nadège Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales” (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.
Materials
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100x, NA1.49.), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10×500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37°C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4°C before use |
References
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. . Encyclopedia of Cell Biology. 2, 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
