הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג'ין או טיפול תרופתי
Summary
Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.
Abstract
Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.
Introduction
הגבלה של טיפולי HIV-1 הנוכחיים היא שהם צריכים להתנהל באופן כרוני כדי למנוע התקדמות מחלה. להשתלות של HIV-1 עמיד לימפוציטים T, או תאי גזע hematopoietic, יש את הפוטנציאל לספק בקרה לטווח ארוך של שכפול HIV-1 בהעדר טיפול תרופתי 1,2 ויכול גם להיות גישה יעילה להשיג תרופה HIV-1 3. דרך אחת להפוך תאים עמידים שכפול HIV-1 היא להכניס גנים אחד או יותר קידוד עבור אנטי HIV-1 RNAs או פפטידים לתוך התאים של אדם שנדבק במהלך השתלה עצמית 4. כמה המועמד גנים אנטי HIV-1 עוצבו עם כמה ניסויים קליניים נכנסים שילובים של שני 5 או שלוש 6, כדי למנוע התפתחות של עמידות HIV-1 לכל גן יחיד.
RNAs-1 נגד HIV הוא בין המועמדים הבולטים עבור ריפוי גנטי שילוב בשל הפוטנציאל הנמוך שלהם לעורר תגובה חיסונית ובגלל שהםמשועתק מתוך רצפי גנים מאוד קצרים. חלק RNAs נגד HIV-1 עוצב למקד כניסה ושילוב ויראלי. עם זאת, רוב RNAs נגד HIV-1 למקד צעדים שלאחר אינטגרציה במחזור החיים של הנגיף (איור 1). מעכבי פוסט אינטגרציה כוללים RNAs דמה, מיקוד חלבונים רגולטוריים HIV-1 טאט או Rev 1, ו RNAs מבוססי antisense, מיקוד אתרים שונים HIV-1 RNA, כגון ribozymes 7, shRNAs 8 ו U1i 9 RNAs. שיטות שנוצלו כדי להשוות את היעילות של RNAs נגד HIV-1 כוללות ניטור שכפולה נגיפית בתאי transduced עם גני מקודדי RNAs מועמד למדידת ייצור נגיפי בתאי transfected זמני עם פלסמידים להביע RNAs מועמד פלסמיד ביטוי HIV-1 10 -13. השתמשנו בעבר assay ייצור HIV-1 להקרין HIV-1 RNA עבור אתרי היעד ribozyme חדש 13-15. שיטות אלה שוכללו מאז כדי לייעל את הפורמט של RNAמולקולת פרעות הביעה מ- DNA פלסמיד כקובץ shRNA או נמסרה בתור siRNA סינטטי 16. את assay מודד את הייצור של וירוסים בוגרים מן הכליות עובריות אנושיים (HEK) תאי 293T, וניתן להשתמש בו כדי להשוות את ההשפעות של מעכבים כי למקד צעדים שלאחר אינטגרציה במחזור שהכפול HIV-1 (איור 1). עבור מעכבים כי למקד צעדים מראש אינטגרציה, מבחנים חלופיים כגון assay infectivity תא TZM-bl 17 נדרשים להעריך יעילות אנטי.
חששות בטיחות סרן עבור המשלוח של אנטי HIV-1 RNAs במרפאת כוללים השפעות חוץ-היעד פוטנציאליות על RNAs אדם או חלבונים, והפעלה של חיישני חיסון מולדים. כדי להעריך את הרעילות של siRNAs נגד HIV-1, השתמשנו assay כדאיות התא שורות תאים שונות 16. כמו כן, אנו נמדדים הפעלה של החיישנים החיסוניים גדילי RNA הכפולים, R פרוטאין קינאז מופעל RNA (PKR) ו אגרה כמו 3 קולטן (TLR3), כמו גם לשעברpression של אינטרפרון מגורה גן, p150 ADAR1. מבחנים אלה יכולים לשמש כדי לאשר את היעילות של RNAs נגד HIV-1 הוא לא בשל השפעות עקיפות על כדאיויות תא או הפעלת חיישן חיסונית. הם גם שימושי למעט RNAs מועמד עם רעילות פוטנציאל להתפתח הלאה.
ב הפרוטוקולים הבאים, נהלים לזהות RNAs הטיפולית חדשות ולבצע אופטימיזציה של הפורמט של התנחלויות קיימות מתואר. השיטות שימושיות מעכבי אינטגרציה שלאחר מבוסס RNA הקרנת שכפול HIV-1 יכולות להיות מותאמות למסך מעכבים שלאחר אינטגרציה אחרות, כגון מולקולות קטנות מיקוד יצוא Rev בתיווך של רנ"א הנגיפי 18 או CRISPR / מערכות קאש שנועדו למקד משולבות HIV-1 DNA 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
את assay ייצור HIV-1 תיאר בוצעה באמצעות תאים HEK293T (איור 2), והוא דומה מבחני לשמש מסך HIV-1 RNA עבור ribozyme שנכנס לתוקף ב -13, shRNA 10,29, siRNA 30, ו U1i RNA 11,31 אתרי היעד. באמצעות שיטות שונות כדי לכמת ייצור HIV-1, רוב המחקרים מדדו ייצור ויראלי 48 שעות לאחר שיתוף transfecti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה המוצגת כאן נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) (מעניק DCB-120,266, PPP-133,377 ו HBF-348,967 ל AG).
Materials
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL – Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
References
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
- Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
- Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
- Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
- Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
- Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
- McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
- Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
- Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
- Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
- Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
- Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
- Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
- Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
- Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev – mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
- Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
- Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
- Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
- Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
- Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
- ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
- Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
- Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
- Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
- Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
- Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
- Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
- Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
- Riss, T. L., et al., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual. , (2004).
- Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
- Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).
