유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가
Summary
Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.
Abstract
Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.
Introduction
현재 HIV-1 치료의 한계는 만성적 질환의 진행을 방지하기 위해 투여되어야한다는 것이다. HIV-1에 강한 T 림프구 또는 조혈 줄기 세포 이식, 약물 치료 -1,2-의 부재 HIV-1 복제의 장기간 제어를 제공하는 가능성을 가지며 또한 HIV-1 치료를 달성하기위한 효과적인 방법이 될 수있다 3. HIV-1 복제에 대해 내성 세포를 렌더링하기위한 한 가지 방법은자가 이식 동안 4 감염된 개인의 세포에 항 HIV-1 RNA를 또는 펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 삽입하는 것이다. 여러 후보 항 HIV-1 유전자는 단일 유전자에 HIV-1의 저항 현상을 방지하기 위해, 두 개 또는 세 개의 5 (6)의 조합에 일부 진입하여 임상 시험을 고안 하였다.
항 HIV-1 RNA를 인해 면역 반응을 유도하는 그들의 낮은 전위로하고 있기 때문에 결합 유전자 치료에 대한 상위 후보자들이다매우 짧은 유전자 서열로부터 전사된다. 일부 항 HIV-1 RNA를이 바이러스 항목 및 통합을 목표로 설계되었습니다. 그러나, 대부분의 항 HIV-1 RNA를는 바이러스 라이프 사이클 후 통합 단계 (도 1)을 대상. 후 통합 억제제는 리보 자임 (7), shRNA를 8 U1i RNA를 9로는 HIV-1 조절 단백질 문신 또는 계 1, 및 안티센스 기반의 RNA를 대상으로 HIV-1 RNA에 다른 사이트를 대상으로, 미끼 RNA를 포함. 항 HIV-1 RNA를의 효능을 비교하기 위해 사용 된 방법은 유전자 후보 RNA를 코딩하는 바이러스 성 일시적 후보의 RNA를 발현하는 플라스미드로 형질 감염된 세포에서 생산 및 HIV-1 발현 플라스미드를 측정 형질 세포에서 바이러스 복제를 모니터링 포함 10 -13. 우리는 이전에 새로운 리보 자임 대상 사이트 13 ~ 15에 대한 HIV-1 RNA를 선별하는 HIV-1 생산 분석을 사용했다. 이러한 방법은 RNA 인 이후의 포맷을 최적화하기 위해 정제 된간섭은 분자의 shRNA로 플라스미드 DNA로부터 발현 또는 합성 siRNA를 16로 전달. 상기 분석은 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포로부터 성숙 바이러스의 생산을 측정하고 (도 1) HIV-1 복제 사이클 후 통합 단계를 타겟팅 억제제의 효과를 비교하기 위해 사용될 수있다. 사전 통합 단계를 타겟팅 억제제를 들면, TZM-BL 세포 감염 분석 (17)와 같은 다른 분석은 항 바이러스 효능을 평가하기 위해 필요하다.
병원에서 항 HIV-1 RNA를의 전달을위한 주요 안전 문제는 인간의 RNA 또는 단백질과 선천성 면역 센서의 작동에 잠재적 인 오프 대상 효과를 포함한다. 항 HIV-1 siRNA의 독성을 평가하기 위해 다른 세포주 16 세포 생존력 분석을 이용했다. 우리는 또한 이중 가닥 RNA 면역 센서의 활성화를 측정 RNA 활성화 단백질 키나제 R (PKR) 및 수용체 3 (TLR3) 등 수신자뿐 아니라 전인터페론의 Pression의 유전자, ADAR1의 P150을 자극. 이러한 분석은 항 HIV-1 RNA를 효능은 세포 생존 또는 면역 센서의 활성화에 대한 간접적 인 효과에 기인 아니라는 것을 확인하는데 사용될 수있다. 또한 발전에서 잠재적 인 독성과 후보 RNA를 제외 유용하다.
다음 프로토콜에서, 절차는 새로운 치료의 RNA를 확인하고, 기존의 형식을 설명하는 최적화. 방법은 HIV-1 복제의 심사 RNA 기반 후 통합 억제제에 유용과 같은 바이러스 성 RNA 18 CRISPR의 레브 매개 수출을 대상으로 작은 분자와 같은 다른 후 통합 억제제를 화면에 적용 할 수 / 설계 카스 시스템은 통합 대상으로 HIV-1 DNA 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
기재된 HIV-1 생산 분석법 HEK293T 셀들 (도 2)를 이용하여 수행하고, 효과적인 리보 자임 (13) shRNA를 10,29, siRNA를 30 및 U1i RNA 11,31 표적 부위를 HIV-1 RNA를 선별하는 데 사용되는 분석 비슷 하였다. HIV-1 생성을 정량화하기 위해 다양한 방법을 사용하여, 대부분의 연구는 후보의 RNA와 HIV-1 발현 플라스미드의 공동 형질 감염 후 바이러스 생산을 48 시간으로 측정…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
여기에 제시된 작품은 건강 연구 (CIHR)의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다 (DCB-120266, PPP-133377와 AG에 HBF-348967을 부여).
Materials
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL – Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
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