작은 RNA 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
작은 비 코딩 RNA를의 다양성 (스르나)는 급속하게 확장되고 유전자 조절을 포함한 생물학적 과정에서 자신의 역할이 부상하고있다. 가장 흥미로운 sRNAs은 세포의 외부 발견하고 안정적으로 모든 생물학적 체액에 존재한다. 따라서, 세포 외 sRNAs 질병 바이오 마커의 새로운 클래스를 나타낼 가능성 세포 신호 및 세포 간 통신 네트워크에 참여하고 있습니다. 바이오 마커로서의 가능성을 평가하기 위해, sRNAs 플라즈마, 소변 및 기타 유체에 정량화 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 충분히 내분비 신호로서 세포 sRNAs의 영향을 이해하기 위해서는, 캐리어 수송성 및 세포 및 조직은 세포 외 스르나 풀 기여 생물학적 유체 (예, 플라즈마)에 이들을 보호하고, 세포 수있는 조직 된 결정하는 것이 중요 수용성의 세포 외 스르나를 이용. 이러한 목표를 달성하기 위해, 세포 외 캐리어 고순도의 집단을 분리하는 것이 중요스르나의 프로파일 링 및 정량. 우리는 이전에 지질 단백질, 특히 고밀도 지단백질 (HDL)을, 셀 및 HDL-의 miRNAs 사이의 기능적인 마이크로 RNA (miRNA의) 크게 질병에 변경되는 수송 있음을 증명하고있다. 여기서는 상세히 밀도 구배 초 원심 분리 (DGUC)과 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)를 탠덤 HDL 분리를 이용하는 새로운 프로토콜 높은 모두 사용 하류 프로파일과의 miRNAs 포함한 모든 sRNAs의 정량 고순도 HDL을 얻었다 -throughput 시퀀싱 및 실시간 PCR 접근법. 이 프로토콜은 HDL에 sRNAs의 조사를 위해 귀중한 자원이 될 것입니다.
Introduction
세포 외 비 코딩 작은 RNA를 (sRNAs)는 질병 바이오 마커 및 잠재적 인 치료 대상의 새로운 클래스를 나타낼 가능성 세포 간 통신 (1)를 용이하게한다. 스르나의 가장 널리 연구 유형은 대략 길이가 22 국세청하며 더 이상 전구체 형태 및 기본 증명서 2에서 처리되는 마이크로 RNA (miRNA의)입니다. 전사적의 miRNAs는 단백질 – 전기 변환 및 mRNA의 분해 (2)의 유도의 억제를 통해 유전자 발현을 조절하는 것으로 입증되었다. 그럼에도 불구하고,의 miRNAs는 sRNAs 많은 종류의 하나입니다; sRNAs가 부모의 tRNA (tRNA의 유래 sRNAs, TDR), 작은 핵 RNA를 (스르나 유래 sRNAs, sndRNA), 작은 핵소체의 RNA (snoRNA 파생 sRNAs, snRNA), 리보솜 RNA를에서 절단 될 수있는 (sRNAs, RDR을 rRNA의 유래 ) RNA를 Y (yDR) 및 기타 다른 RNA를 1. 이 소설 sRNAs의 몇 가지 예는 miRNA가 유사한 기능을하는 것으로보고되었다; 그러나, 생물학적 쿵푸유전자 조절의 역할 3-6 가능성이 있지만 이러한 sRNAs의 많은 nctions가 결정되어야 남아있다. 가장 흥미로운의 miRNAs 및 기타 sRNAs는 타액, 혈장, 소변, 담즙를 포함하는 세포 외 체액에서 안정적으로 존재한다. 세포 외 sRNAs 가능성이 세포 외 소포 (EV), 지질 단백질, 및 / 또는 세포 외 리보 핵산 단백질 복합체와의 연결을 통해 RNases로부터 보호됩니다.
이전에, 우리는 지질 단백질, 즉 고밀도 지단백질 (HDL), 플라즈마 7 전송의 miRNAs을보고했다. 본 연구에서는 HDL은 순차적 밀도 구배 초 원심 분리 방법 (DGUC), 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 (크기 배제 크로마토 그래피 겔 여과, FPLC), 및 친 화성 크로마토 그래피 (안티 – 아포 지단백 AI (apoA-I) 면역를 사용하여 분리 하였다 ) 7. 실시간 PCR 기반 저밀도 어레이 개별 miRNA의 분석 모두 사용하여 miRNA의 레벨은 HDL을 정량 치료에서 분리 된네와 콜레스테롤 혈증 환자 7. 이 방법을 사용하여, 우리는의 miRNAs 프로필 및 고순도 HDL 준비의 특정의 miRNAs를 정량화 할 수 있었다. 2011 년부터, 우리는 친 화성 크로마토 그래피는 HDL의 순도를 향상 있지만, 항체 포화 크게 수율을 제한하고 엄청난 비용이 될 수 있다고 판단했다. 현재, 우리의 프로토콜은 다운 스트림 RNA 분리 및 스르나의 정량화를위한 고품질의 HDL 샘플을 생산 FPLC, 다음 DGUC의 2 단계 연속 탠덤 방법을 권장합니다. 때문에 높은 처리량 예를 들어 sRNAs (sRNAseq),의 miRNAs의 순서 및 기타 비 miRNA의 스르나 클래스의 증가에 대한 인식의 최근 진보, sRNAseq는 현재 최첨단의 miRNA 및 스르나 프로파일입니다. 따라서, 우리의 프로토콜은 정량화의 miRNAs와 sRNAseq를 사용하여 HDL 샘플의 다른 sRNAs을 권장합니다. 그럼에도 불구하고, HDL로부터 분리 된 총 RNA는 또한 개별의 miRNAs 다른 sRNAs 정량화 또는 실시간 PCR A를 사용 sRNAseq 결과를 검증하기 위해 사용될 수있다pproaches. 여기에 우리가 수집, 정제, 정량, 데이터 분석 및 고순도 HDL-sRNAs의 검증을 위해 상세 프로토콜을 설명합니다.
이 논문의 전반적인 목표는 인간 혈장에서 분리 된 고순도의 HDL에 스르나 정량의 타당성과 과정을 설명하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 고순도의 HDL에 높은 처리량 시퀀싱 또는 실시간 PCR에 의해 miRNA가 다른 sRNAs을 정량화하기 위해 설계되었습니다. 어떠한 접근 방식으로, 특별한 고려가 정화 HDL 및 RNA의 처리의 각 단계에 부여하고 sRNAs 정량화한다. 이 프로토콜은 플라즈마의 ≥ 2 mL로 시작하는 프로젝트를 위해 설계되었습니다. 그러나 고품질의 RNA 분석을 성공적으로 친 화성 크로마토 그래피를 이용하여 인간 또는…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
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