の検出のためのより高感度で特異的な発色性寒天培地の開発<em>腸炎ビブリオ</em>その他<em>ビブリオ</em>種
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
ビブリオ種によって引き起こさ米国における食品媒介感染症は増加傾向を示しています。 ビブリオ属では、腸炎ビブリオは ビブリオ -関連感染症の大部分を担当しています。したがって、 ビブリオ属の中で正確な分化。そして、Vの検出腸炎は、私たちの食糧供給の安全性を確保することが非常に重要です。分子技術がますます一般的ですが、文化-によって方法はまだ日常的に行われており、それらは特定の状況において標準的な方法を考えています。したがって、新規の発色性寒天培地は、臨床的に関連するビブリオ属の単離および分化のためのより良い方法を提供することを目標に試験しました。プロトコルは、Vの検出感度、特異性および検出限界を比較しました新しい発色性の媒体と従来の媒体との間腸炎 。様々なV.ビブリオ菌株 （N = 22）を再提示多様な血清型および起源のソースを使用しました。彼らは以前に食品医薬品局（FDA）と疾病管理予防センター（CDC）によって識別され、さらにTLH -PCRによって我々の研究室で確認されました。少なくとも4つの別々の試験では、これらの株は24のために35から37℃でインキュベートし、発色性寒天と、この種を培養するための推奨される媒体であるチオ硫酸塩、クエン酸塩 – 胆汁塩 – スクロース（TCBS）寒天、上に接種しました-96時間。三V.腸炎株 （13.6％）は、成長があった場合、それにもかかわらず、緑のコロニーを示し、TCBSに最適に成長しませんでした。二つの株（9.1％）は、発色性寒天に期待シアンコロニーは得られませんでした。非V.ビブリオ菌株 （N = 32）も、発色性寒天の特異性を決定するために試験しました。これらの株のうち、31が成長または他のコロニーの形態を呈していませんでした。 V.の平均回収chromoge上の腸炎NIC寒天を2％のNaClを補充したトリプシン大豆寒天に比べて〜96.4パーセントでした。結論として、新たな発色性寒天はVを検出するための効果的な媒体であります他のビブリオ菌と区別するために腸炎と。
Introduction
ビブリオ属 、Vの一員として腸炎は、グラム陰性、非胞子形成、湾曲した棒状の細菌です。それは、液体および半固体の環境の両方で高い運動性を示します。ほとんどのV.ビブリオ株はヒトに非病原性である、まだ病原性サブタイプが故に、この種は多くの国1,2における重要な食品媒介病原体であると考えられ、流行やパンデミックを引き起こしました。米国のビブリオ感染症の発生率は、2000年3以降上昇傾向を示している。 ビブリオ属のうち、V.腸炎は、米国4,5に病気を引き起こす最も頻繁に報告さ種です。他の臨床的に関連する種は、Vを含みますalginolyticus、V.バルニフィカス 、V.コレラ などの病気の小さな割合は、同時に複数の種によって引き起こされます。
腸炎ビブリオは自然な私です海洋水のnhabitantので、広く河口を含む世界中の海域に分布します。種は、日本での食中毒の発生、次の1950年に発見されました。米国では、種はまず、海水、堆積物、およびピュージェットサウンド地域6,7貝で単離しました。このような二枚貝などの海洋生息地、で濾過摂食は、Vを抱くことができます彼らの自然な細菌叢8の一環として、 腸炎 。このような、Vとしてヒトにおける腸炎感染症は、多くの場合、汚染された魚介類の消費量、特に生や加熱が不十分な貝にリンクされています。開いた傷は皮膚感染につながる、海水にさらされたとき、エントリの少ない一般的な経路が発生します。ほとんどのV.ビブリオ株は、ヒトの疾患を引き起こすことはありませんが、まだそのような耐熱性溶血毒（TDH）などの病原性因子を保有する特定のサブタイプが病原性です。食品媒介Vの最も一般的な症状ビブリオ感染症であります下痢や腹痛、吐き気、嘔吐、発熱が続きます。頭痛と悪寒も報告されています。中央値潜伏期間は15時間ですが、病原性株9の十分な量を消費した後に、最大96時間にすることができます。病気は、2〜3日から続きます。 V.によって引き起こされる胃腸炎の症状腸炎は、主に自己限定的であり、したがって、特別な治療は必要ありません。胃腸炎の軽度の例は、効果的に経口補水によって治療することができます。もっと深刻な病気は、テトラサイクリンまたはシプロフロキサシン10のような抗生物質によって治療することができます。死亡率は、胃腸炎の場合の約2％であるが、血流感染または敗血症を発症する人のための29％と高くすることができます。魚介類を消費するか、開いた傷口海水にさらされた者は、Vの危険性がありますビブリオ感染症。病気のより深刻な形、生命を脅かす敗血症は、基礎疾患共同で亜集団においてより一般的ですアルコール依存症、肝臓病、糖尿病、腎疾患、悪性腫瘍、および弱まった免疫応答を引き起こす他の条件を含むnditions 11、。特に、個人のこのグループはV.によって引き起こされる深刻な病気を収縮させる高いリスクもありますV.に似た自然の生息地で見つけることができますバルニフィカス 、 腸炎 。
腸炎ビブリオは、日常的に選択し、差動媒体としてチオ硫酸塩、クエン酸塩-胆汁塩-スクロース（TCBS）寒天を用いて単離します。アルカリペプトン水に濃縮はTCBS寒天上分離に先行してもよいです。 TCBSの推定コロニーは、その後さらに、種特異的遺伝子の存在を標的生化学的試験及び/又は分子アッセイのアレイで試験します。 PCRベースの方法は、多くの場合、Vの身元を確認するために使用されています12 TLH、熱不安定性溶血素遺伝子を増幅することにより腸炎 。
関係なくCHの確認方法のOICEは、Vを分離し、区別するために効果的な媒体を有することが重要です最初の場所で他の海洋ビブリオ菌から腸炎 。 TCBSは、日常的にショ糖12を発酵する能力に応じたビブリオ属内の種を区別するために使用されています。正の発酵反応は、pH指示薬ブロモチモールブルーの色の変化を伴う。V.腸炎コロニーは緑色に青呈する、TCBSにかなり独特です。しかし、この媒体は、簡単にVを区別することはできませんalginolyticusとV.コレラ菌。ショ糖発酵プロテウス種はV.に似た黄色のコロニーを生成することができますコレラ菌やV. 13 alginolyticus。 TCBS、V.上の最初の単離に腸炎はまた、 アエロモナス細菌、プレシオモナスのshigelloides、およびシュードモナス属 14と誤認することができます。遅延スクロースFERMで株entationはVを含むビブリオ 13非発酵他のショ糖と混同することができます腸炎 。 TCBSはとりわけ、 大腸菌 、 シュードモナスputrefaciensに対して敏感ではないことが判明しました。いくつかの他の種は、潜在的にV.と混同されている灰色のコロニーに緑得腸炎またはV.バルニフィカス 15。その結果、検出およびVの単離に向けて良好な感度と特異性を有する代替培地を開発することが望ましいです。 腸炎や他の近縁種。
いくつかのメディアの選択肢が最近開発されてきました。選択剤の含有に加えて、最もその差の酵素活性に基づいて種を区別するために発色基質を組み込みます。例えば、インドキシル-βグルコシド及びインドキシル-βガラクトシドはVを区別するために発色性基質として使用されていますパラV.のものとは（青緑色表示されます）溶血性コロニーβグルコシダーゼおよびβガラクトシダーゼ16を生成するために、それらの差動能力にコレラ菌 （紫）。いくつかのグループによって開発された発色性寒天の異なる製剤が評価されたとの同等またはTCBS 17,18,19の値より実行することが報告されました。発色性媒体を使用する利点は、周囲の媒体の着色は、それによって特定のコロニーの単離を容易に最小であることです。本研究では、Vを検出し、単離するため、新たに策定発色性媒体の能力を評価しましたコレラ菌 、V.腸炎 、およびV.バルニフィカス ; V.を区別する能力に特別な焦点を当てて他の種からの腸炎 。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、培養培地の開発、評価に焦点を当てています。従来、TCBSは選択的であり、培地Vを分離し、検出するために用いられる差分腸炎、コレラ菌とV.バルニフィカス 12。しかし、制限は、このようなVを区別することができないように、この媒体について報告されています他のビブリオ種からコレラ菌 。スクロースおよびpH指示薬は、TCBの…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、プロジェクトの彼らの援助のためにM. Channey、E.チャウ、およびK.トーマスに感謝します。プロジェクト物資の一部は、カリフォルニアポリテクニック州立大学が資金を提供しました。
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | Environnement | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
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