Utvikling av en mer sensitiv og spesifikk kromogen Agar Medium for deteksjon av<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Og annet<em> Vibrio</em> Arter
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
Matbårne infeksjoner i USA forårsaket av Vibrio-arter har vist en oppadgående trend. I slekten Vibrio, V. parahaemolyticus er ansvarlig for de fleste av Vibrio -associated infeksjoner. Dermed nøyaktig differensiering blant Vibrio spp. og påvisning av V. parahaemolyticus er kritisk viktig for å ivareta sikkerheten for vår matforsyning. Selv om molekylære teknikker blir stadig vanligere, er kultur avhengig metoder fortsatt rutinemessig gjort, og de anses standard metoder under visse omstendigheter. Derfor ble en roman kromogent agar medium testet med mål om å tilby en bedre metode for isolering og differensiering av klinisk relevant Vibrio spp. Protokollen sammen følsomhet, nøyaktighet og deteksjonsgrensen for påvisning av V. parahaemolyticus mellom den nye kromogene medium og et konvensjonelt medium. Various V. parahaemolyticus stammer (n = 22) representasjon av forskjellige serotyper og kilde opprinnelse ble anvendt. De ble tidligere identifisert av Food and Drug Administration (FDA) og Centers for Disease Control and Prevention (CDC), og ytterligere bekreftet i vårt laboratorium ved TLH -PCR. I minst fire separate forsøk, ble disse stammer inokulert på de kromogene agar og tiosulfat-citrat-gallesalter-sukrose (TCBS)-agar, som er den anbefalte medium for dyrkning av denne arten, etterfulgt av inkubering ved 35-37 ° C i 24 -96 hr. Tre V. parahaemolyticus stammer (13,6%) vokste ikke optimalt på TCBS, likevel viste grønne kolonier hvis det var vekst. To stammer (9,1%) ikke gir de forventede cyan kolonier på kromogent agar. Ikke- V. parahaemolyticus stammer (n = 32) ble også testet for å bestemme spesifisiteten av den kromogene agar. Blant disse stammene, gjorde 31 ikke vokse eller utstilt andre koloni morfologi. Den midlere gjenvinning av V. parahaemolyticus på chromogenic agar var ~ 96,4% i forhold til tryptisk soyaagar supplert med 2% NaCl. I konklusjonen, er den nye kromogent agar et effektivt medium for å oppdage V. parahaemolyticus og å skille den fra andre Vibrio-arter.
Introduction
Som medlem av Vibrio slekten, V. parahaemolyticus er en Gram-negative, ikke-sporedannende, buet, stavformet bakterie. Det oppviser høy bevegelighet i både flytende og halvfaste miljøer. Mest V. parahaemolyticus stammer er ikke-patogene for mennesker, men de patogene subtyper har forårsaket epidemier og pandemier, derav denne arten anses å være en viktig matbåren patogen i mange land 1,2. Forekomsten av Vibrio infeksjon i USA har vist en oppadgående trend siden 2000 tre. Blant Vibrio spp., V. parahaemolyticus er de hyppigst rapporterte arter forårsaker sykdommer i USA 4,5. Andre klinisk relevante arter inkluderer V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. En liten prosentandel av sykdommer forårsaket av flere arter samtidig.
V. parahaemolyticus er en naturlig jegnhabitant av marine vann og derfor utbredt i marine farvann over hele verden, inkludert elvemunninger. Arten ble oppdaget i 1950 etter et utbrudd av matforgiftning i Japan. I USA ble arten først isolert i sjøvann, sedimenter og skalldyr i Puget Sound regionen 6,7. Filter feeders i marine habitater, for eksempel skjell skalldyr, kan havnen V. parahaemolyticus som en del av deres naturlige flora 8. Som sådan, V. parahaemolyticus infeksjoner hos mennesker er ofte knyttet til inntak av forurenset sjømat, spesielt rå eller kokt skalldyr. En mindre vanlig svei skjer når åpent sår er utsatt for sjøvann, noe som fører til hudinfeksjon. Mest V. parahaemolyticus stammer ikke forårsake sykdom hos mennesker, men enkelte subtyper husing virulens faktorer som termostabile direkte hemolysin (TDH) er sykdomsfremkallende. De mest utbredte symptomer på matbåren V. parahaemolyticus infeksjon erdiaré og magesmerter, fulgt av kvalme, oppkast og feber. Hodepine og frysninger er også rapportert. Median Inkubasjonstiden er 15 timer, men kan være opp til 96 timer etter inntak av tilstrekkelig mengde av patogene stammer 9. Sykdommen varer fra to til tre dager. De gastroenteritt symptomer forårsaket av V. parahaemolyticus er i stor grad selvbegrensende og derfor spesiell behandling er ikke nødvendig. Milde tilfeller av gastroenteritt kan effektivt behandles med oral rehydrering. Mer alvorlige sykdommer kan behandles med antibiotika slik som tetracyklin eller ciprofloksacin 10. Dødeligheten er om lag 2% for gastroenteritt tilfeller, men kan være så høy som 29% av de som utvikler blodbanen infeksjon eller septikemi. Enhver person som bruker sjømat eller har åpne sår utsettes for sjøvann er i fare for V. parahaemolyticus infeksjon. Jo mer alvorlig form av sykdommer, livstruende sepsis, er mer vanlig i en undergruppe med underliggende medisinsk cold 11, som omfatter alkoholisme, leversykdom, diabetes, nyresykdommer, kreft, og andre tilstander som fører til en svekket immunrespons. Spesielt er denne gruppen av individer også på et høyere risiko for å pådra alvorlige sykdommer forårsaket av V. vulnificus, som kan finnes i naturlige habitater som ligner på V. parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus er rutinemessig isolert ved anvendelse av tiosulfat-citrat-gallesalter-sukrose (TCBS) agar som et selektivt og differensielt medium. Berikelse i alkalisk peptonvann kan gå forut for isolasjon på TCBS agar. Presumptive kolonier på TCBS deretter videre testet i en rekke biokjemiske tester og / eller molekylære analyser rettet mot tilstedeværelsen av artsspesifikke gener. PCR-baserte metoder blir ofte brukt til å bekrefte identiteten til V. parahaemolyticus ved å forsterke de termo hemolysin genet, TLH 12.
Uavhengig av choice av bekreftelsesmetoden, er det viktig å ha et effektivt medium for å isolere og skille V. parahaemolyticus fra andre marine Vibrio-arter i første omgang. TCBS har rutinemessig blitt brukt til å skille arter innenfor Vibrio slekten i henhold til deres evner til å gjære sukrose 12. Positive fermenteringsreaksjonen er ledsaget av en fargeendring i pH-indikator bromtymolblått. V. parahaemolyticus kolonier er ganske særegent på TCBS, viser blå til grønn farge. Imidlertid kan dette mediet ikke lett å skille V. alginolyticus og V. cholerae. Sukrose-fermen Proteus arter kan produsere gule kolonier som ligner V. cholerae eller V. alginolyticus 13. Ved første gangs isolasjon på TCBS, V. parahaemolyticus kan også bli feilidentifisert som Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, og Pseudomonas spp 14. Stammer med forsinket sukrose fermentering kan forveksles med andre sukrose nonfermenting Vibrio 13, som inkluderer V. parahaemolyticus. TCBS ble funnet å være ikke følsomt mot Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, blant andre. Flere andre arter gi grønt til grå kolonier som er potensielt forveksles med V. parahaemolyticus eller V. vulnificus 15. Som et resultat, er det ønskelig å utvikle alternative kulturmedier med bedre følsomhet og spesifisitet mot å detektere og isolere V. parahaemolyticus og andre nær beslektede arter.
Flere medie alternativer har nylig blitt utviklet. I tillegg til å inkludere selektive midler, mest innlemme kromogene substrater for å skille arter basert på deres differensial enzymatiske aktiviteter. For eksempel har indoksyl-β-glukosid og indoxyl-β-galaktosid blitt anvendt som de kromogene substrater for å skille V. parahaemolyticus kolonier (som vises blågrønn) fra de av V. cholerae (purpur) på grunn av deres differensielle evner til å produsere β-glukosidase og β-galaktosidase 16. Ulike formuleringer av kromogent agar utviklet av flere grupper har blitt evaluert og ble rapportert å utføre sammenlign eller bedre enn TCBS 17,18,19. En fordel ved å bruke et kromogent medium er at farging av det omgivende medium er minimalt for derved å lette isoleringen av bestemte kolonier. I denne studien evaluerte vi muligheten for en nylig formulert kromogent medium for å påvise og isolere V. cholerae, V. parahaemolyticus og V. vulnificus; med et spesielt fokus på sin evne til å skille V. parahaemolyticus fra andre arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne studien fokuserer på kultur medieutvikling og evaluering. Konvensjonelt, er TCBS den selektivt og differensielt medium som brukes for å isolere og detektere V. parahaemolyticus, V. cholerae og V. vulnificus 12. Imidlertid begrensninger har vært rapportert for dette medium, slik som manglende evne til å skille V. cholerae fra andre Vibrio-artene. Sukrose og pH-indikator er differensiering agenter for TCBS. Således syreproduksjon av sakkarose fermenter bevirker far…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker M. Channey, E. Chau, og K. Tomas for deres hjelp på prosjektet. Prosjekt forsyninger ble delvis finansiert av California Polytechnic State University.
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | Environnement | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- . Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008)
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States – major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. . Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- MacFaddin, J. F. . Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -. C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
