Utveckling av en känsligare och mer specifik kromogena Agar Medium för detektion av<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Och annat<em> Vibrio</em> Arter
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
Livsmedelsburna infektioner i USA orsakas av Vibrio arter har visat en uppåtgående trend. I släktet Vibrio, V. parahaemolyticus är ansvarig för majoriteten av Vibrio -associated infektioner. Således, exakt differentiering mellan Vibrio spp. och detektion av V. parahaemolyticus är mycket viktigt att garantera säkerheten för vår livsmedelsförsörjning. Även molekylära tekniker blir allt vanligare, är kultur beroende metoder fortfarande rutinmässigt gjort och de anses standardmetoder under vissa omständigheter. Därför genomfördes en ny kromogent agarmedium testas med målet att ge en bättre metod för isolering och differentiering av kliniskt relevant Vibrio spp. Protokollet jämförde känslighet, specificitet och detektionsgränsen för detektion av V. parahaemolyticus mellan den nya kromogena mediet och en konventionellt medium. Various V. parahaemolyticus stammar (n = 22) återpresenterar olika serotyper och källa till ursprung användes. De tidigare identifierats av Food and Drug Administration (FDA) och Centers for Disease Control and Prevention (CDC), och ytterligare verifieras i vårt laboratorium genom tlh -PCR. I åtminstone fyra separata studier har dessa stammar ympades på kromogena agar och tiosulfat-citrat-gallsalter-sackaros (TCBS) agar, vilket är den rekommenderade mediet för odling denna art, följt av inkubation vid 35-37 ° C under 24 -96 h. Tre V. parahaemolyticus stammar (13,6%) inte växer optimalt på TCBS ändå uppvisade gröna kolonier om det fanns tillväxt. Två stammar (9,1%) inte gav de förväntade cyan kolonier på kromogena agar. Icke- V. parahaemolyticus stammar (n = 32) testades också för att bestämma specificiteten av det kromogena agar. Bland dessa stammar, gjorde 31 inte växa eller uppvisade andra kolonimorfologier. Medelförekomsten av V. parahaemolyticus på chromogenic-agar var ~ 96,4% i förhållande till tryptisk sojaagar kompletterat med 2% NaCl. Sammanfattningsvis är den nya kromogena agar ett effektivt medium för att detektera V. parahaemolyticus och att skilja den från andra vibrios.
Introduction
Som en medlem av Vibrio släktet, V. parahaemolyticus är en gramnegativ, icke-sporbildande, krökt, stavformad bakterie. Den uppvisar hög rörlighet i både flytande och halvfasta miljöer. Mest V. parahaemolyticus stammar är icke-patogen för människor, men de patogena subtyper har orsakat epidemier och pandemier, därav denna art anses vara en viktig livsmedelsburna patogener i många länder 1,2. Förekomsten av Vibrio infektion i USA har visat en uppåtgående trend sedan 2000 3. Bland Vibrio spp., V. parahaemolyticus är de mest frekvent rapporterade arter orsakar sjukdomar i USA 4,5. Andra kliniskt relevanta arter är V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. En liten andel av de sjukdomar som orsakas av flera arter samtidigt.
V. parahaemolyticus är en naturlig inhabitant av havsvatten och därför stor spridning i marina vatten i hela världen, inklusive mynningar. Arten upptäcktes 1950 efter ett utbrott av matförgiftning i Japan. I USA, var arten först isolerades i havsvatten, sediment och skaldjur i Puget Sound regionen 6,7. Filtrerare i marina miljöer, såsom musslor, kan hysa V. parahaemolyticus som en del av deras naturliga flora 8. Som sådan, V. parahaemolyticus infektioner hos människa är ofta kopplade till konsumtion av förorenad fisk och skaldjur, särskilt råa eller svampiga skaldjur. En mindre vanlig upptagsväg uppstår när öppna sår utsätts för havsvatten, vilket leder till hudinfektion. Mest V. parahaemolyticus stammar inte orsakar sjukdom hos människor, men vissa subtyper hyser virulensfaktorer såsom värme direkt hemolysin (TDH) är patogena. De vanligaste symptomen på livsmedelsburna V. parahaemolyticus infektion ärdiarré och magsmärtor, följt av illamående, kräkningar och feber. Huvudvärk och frossa är också rapporterats. Median Inkubationstiden är 15 h, men kan vara upp till 96 timmar efter intag av tillräcklig mängd av patogena stammar 9. Sjukdomen varar från två till tre dagar. De gastroenterit symptom orsakade av V. parahaemolyticus är till stor del självbegränsande och därför särskild behandling är inte nödvändigt. Lindriga fall av gastroenterit kan behandlas effektivt med vätskeersättning. Mer allvarliga sjukdomar kan behandlas med antibiotika, såsom tetracyklin eller ciprofloxacin 10. Dödligheten är ca 2% för gastroenterit fall, men kan vara så hög som 29% för dem som utvecklar blodomloppet infektion eller blodförgiftning. Varje person som konsumerar skaldjur eller har öppet sår utsätts för havsvatten är i riskzonen för V. parahaemolyticus infektion. Ju mer allvarlig form av sjukdomar, livshotande blodförgiftning, är vanligare i en subpopulation med underliggande medicinska conditions 11, som innefattar alkoholism, leversjukdomar, diabetes, njursjukdom, malignitet och andra tillstånd som leder till ett försvagat immunsvar. Noterbart är denna grupp av individer också en högre risk för att drabbas av allvarliga sjukdomar som orsakas av V. vulnificus, som kan hittas i naturliga livsmiljöer som liknar V. parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus rutinmässigt isoleras med hjälp av tiosulfat-citrat-gallsalter-sackaros (TCBS) agar som ett selektivt och differentiellt medium. Anrikning i alkaliskt peptonvatten kan föregå isolering på TCBS agar. Presumtiva kolonier på TCBS sedan ytterligare testas i en rad biokemiska tester och / eller molekylära analyser riktade mot närvaron av artspecifika gener. PCR-baserade metoder används ofta för att bekräfta identiteten på V. parahaemolyticus genom att förstärka den termolabila hemolysin-genen, tlh 12.
Oberoende av lmoice av bekräftelsemetoder, är det viktigt att ha ett effektivt medium för att isolera och särskilja V. parahaemolyticus från andra marina vibrioner i första hand. TCBS har rutinmässigt använts för att skilja arterna inom Vibrio släktet enligt deras förmåga att jäsa sackaros 12. Positiv jäsningsreaktion åtföljs av en färgförändring av pH-indikator Bromtymolblått. V. parahaemolyticus kolonier är ganska utmärkande på TCBS, uppvisar blå till grön färg. Dock kan detta medium inte lätt skilja V. alginolyticus och V. cholerae. Sackaros-jäsa Proteus arter kan producera gula kolonier som liknar V. cholerae eller V. alginolyticus 13. Vid första isolering på TCBS, V. parahaemolyticus kan också feltolkas som Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, och Pseudomonas spp 14. Stammar med fördröjd sackaros fermsenta kan förväxlas med andra sackaros nonfermenting Vibrio 13, som omfattar V. parahaemolyticus. TCBS befanns vara inte känslig mot Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens, bland andra. Flera andra arter ger grönt till grått kolonier som potentiellt förväxlas med V. parahaemolyticus eller V. vulnificus 15. Som ett resultat, är det önskvärt att utveckla alternativa odlingsmedia med bättre känslighet och specificitet mot detektering och isolering av V. parahaemolyticus och andra närbesläktade arter.
Flera medier alternativ har nyligen utvecklats. Förutom införandet av selektiva medel, de flesta införliva kromogena substrat för att skilja arterna baserat på deras differentiella enzymatiska aktiviteter. Till exempel, har indoxyl-β-glukosid och indoxyl-β-galaktosid använts som de kromogena substrat för att differentiera V. parahaemolyticus kolonier (som verkar blågrönt) från de V. cholerae (lila) på grund av deras differentiella förmåga att producera β-glukosidas och β-galaktosidas 16. Olika formuleringar av kromogena agar som utvecklats av flera grupper har utvärderats och rapporterades att utföra jämförbart med eller bättre än TCBS 17,18,19. En fördel med användning av ett kromogent medium är att färgningen av det omgivande mediet är minimal vilket underlättar isoleringen av speciella kolonier. I denna studie har vi utvärderat förmågan hos ett nyligen formulerade kromogent medium för att detektera och isolera V. cholerae, V. parahaemolyticus och V. vulnificus; med särskilt fokus på dess förmåga att särskilja V. parahaemolyticus från andra arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie fokuserar på odlingsmedia utveckling och utvärdering. Konventionellt är TCBS selektivt och differentiellt medium används för isolering och detektion av V. parahaemolyticus, V. cholerae och V. vulnificus 12. Emellertid har begränsningar rapporterats för detta medium, såsom oförmågan att differentiera V. cholerae från andra Vibrio arter. Sackaros och pH-indikator är de differentierings agenter TCBS. Således, syraproduktionen av sackaros fermentorn or…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar M. Channey, E. Chau, och K. Tomas för deras hjälp i projektet. Projekt leveranser var delvis finansierat av California Polytechnic State University.
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | Environnement | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
References
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- . Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008)
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States – major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. . Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- MacFaddin, J. F. . Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -. C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
