Le protocole suivant décrit la préparation et l’utilisation de tampons pour la mesure quantitative des taux d’oxydation du glucose et des acides gras dans le cœur isolé du rat actif. Les méthodes utilisées pour l’analyse des échantillons et l’interprétation des données sont également abordées.
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Article de méthode
Méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le coeur de mammifère est un grand consommateur d'ATP et nécessite un apport constant de substrats énergétiques pour la contraction. Sans surprise, les altérations du métabolisme du myocarde ont été associés au développement d'un dysfonctionnement contractile et l'insuffisance cardiaque. Par conséquent, démêler le lien entre le métabolisme et la contraction devrait faire la lumière sur certains des mécanismes qui régissent l'adaptation cardiaque ou maladaptation dans les états pathologiques. L'isolement de travail de préparation de coeur de rat peut être utilisé pour suivre simultanément et en temps réel, la fonction contractile cardiaque et le flux d'énergie fournissant des substrats dans des voies métaboliques oxydatives. Le présent protocole vise à fournir une description détaillée des méthodes utilisées dans la préparation et l'utilisation de tampons pour la mesure quantitative des taux d'oxydation du glucose et des acides gras, l'énergie principale fournissant des substrats du cœur. Les méthodes utilisées pour l'analyse de l'échantillon et l'interprétation des données sont également discutés.En bref, la technique est basée sur la fourniture de 14 C- glucose radiomarqué et un acide gras à longue chaîne radiomarqué 3 H- à un cœur battant ex vivo par perfusion cristalloïde normothermique. 14 CO 2 et 3 H 2 O, fin des sous - produits de les réactions enzymatiques impliquées dans l'utilisation de ces substrats énergétiques fournissant, sont ensuite quantitativement récupérées à partir de l'effluent coronaire. Avec la connaissance de l'activité spécifique des substrats radiomarqués utilisés, il est alors possible de quantifier individuellement le flux de glucose et d'acide gras dans les voies d'oxydation. la fonction contractile du cœur isolé peut être déterminée en parallèle avec l'appareil d'enregistrement approprié et directement corrélé aux valeurs de flux métaboliques. La technique est très utile pour étudier la relation métabolisme / contraction en réponse à diverses conditions de stress telles que des altérations de pré et après la charge et de l'ischémie, un médicament ou un circulafacteur ting ou après la modification de l'expression d'un produit génique.
Introduction
Pertinence clinique
Au coeur des mammifères, il existe une forte relation positive entre le flux de substrats par les voies métaboliques oxydatives, la génération d' ATP et le travail cardiaque 1. Au cours des deux dernières décennies, l'enquête sur le lien complexe entre le métabolisme et la fonction cardiaque a conduit à reconnaître que des altérations du métabolisme cardiaque sont une cause de dysfonctionnement contractile et le remodelage structurel éventuellement pathologique dans le cadre de différents types de maladies cardiaques 2-4. Par conséquent, il est prévu que notre compréhension des mécanismes ....
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Protocole
NOTE: Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément à la politique du Service de santé publique sur le NIH Human Care et l'utilisation des animaux et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université du Mississippi Medical Center. Toutes les procédures impliquant l'utilisation de radioisotopes ont été approuvés et réalisés selon les lignes directrices établies par le bureau de l'Université du Mississippi Medical Center de sûreté radiologique.
1. Préparation du stock tampon Solutions et réactifs
- Krebs-Henseleit (KH) du stock régulateur Solu....
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Résultats
Deux expériences représentatives sont décrites dans les figures ci-dessous. Dans les deux cas, le coeur d'un homme âgé de 16 semaines chez le rat Sprague Dawley a été isolé et perfusé dans le mode de fonctionnement avec un tampon KH préparé selon le protocole précédent. Dans chaque expérience, le cœur a été soumis à une condition de stress pour affecter le travail cardiaque. la fonction contractile cardiaque a été évaluée par enregistrement continu de la pression d'impulsion par .......
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Discussion
Le protocole précédent décrit en détail les méthodes pour quantifier simultanément le flux du substrat à travers l'oxydation du glucose et de l'oxydation des acides gras dans le coeur de rat isolé de travail. Les mesures peuvent ensuite être superposées aux paramètres fonctionnels cardiaques enregistrés pour déterminer la relation entre les substrats du métabolisme et du travail cardiaque sous base et le stress des conditions (changement dans la charge de travail, l' ischémie-reperfusion, etc ...). .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les subventions R00 HL112952 (à R. H.), R01 HL108618 (à J.P.G.), P01 HL051971 et P20 GM104357. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chlorure de sodium (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Chlorure de potassium (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4) | Fisher Scientific | P284 | |
| Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4*7H2O) | Fisher Scientific | M63 | |
| Bicarbonate de sodium (NaHCO3) | Fisher Scientific | S233 | |
| Chlorure de calcium (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| AG 1-X8 résine, forme chlorure, 100 - 200 mailles sèches, 500 g | Bio-Rad | 1401441 | Cet article peut être remplacé en achetant directement la forme d’hydoxide. (voir référence ci-dessous), mais cela coûtera presque 8 fois plus |
| résine AG 1-X8, forme hydroxyde, 100 - 200 mailles sèches, 100 g | de Bio-Rad | 1432445 | L’achat de cet article permet de contourner la conversion de la résine échangeuse d’anions de la forme chlorure à la forme hydroxyde (Voir section 1.2 du protocole) |
| Porte-filtre sous vide de microanalyse en verre | Fisher Scientific | 09-753-2 | |
| Hydroxyde de sodium (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | Corrosif. Consultez la fiche signalétique du produit pour la manipulation et le stockage appropriés. |
| Tube de dispersion de gaz avec cylindre fritté | Fisher Scientific | 11-138B | |
| Probumin Sérum bovin Albumine Sans acides gras, poudre | EMD Millipore | 820027 | Nous recommandons l’utilisation d’un BSA dégraissé au charbon de bois, car d’autres processus de purification tels que le fractionnement à froid de l’éthanol peuvent laisser des résidus toxiques pour le cœur. |
| Oléate de sodium | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Acide oléique, [9,10-3H(N)]- | PerkinElmer | NET289005MC | Matière radioactive. Suivez les lignes directrices du bureau de radioprotection de votre établissement pour les commandes et les manipulations. |
| Tube à membrane de dialyse, 29 mm de diamètre, | Fisher Scientific | 08-667E | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, | G7021 | |
| Glucose, D-[14C(U)]- | PerkinElmer | NEC042B005MC | Matière radioactive. Suivez les lignes directrices du bureau de radioprotection de votre établissement pour les commandes et les manipulations. |
| Humulin R U-100 | Eli Lilly and Company | NDC 0002-8215-01 (HI-210) | |
| Hydrate d’inactine | Sigma-Aldrich | T133 | Substance contrôlée inscrite à l’annexe III de l’USDEA |
| 3-0 Silk Black Braid | Roboz Surgical | SUT-15-3 | |
| 10x Hyamine Hydroxide | PerkinElmer | 6003005 | Hautement toxique et provoque de graves brûlures. Consulter la fiche signalétique du produit pour une manipulation et un stockage appropriés |
| Flacons en verre à scintillation de 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25F | Utiliser des flacons en verre pour la récupération quantitative des 14CO2 |
| 20 ml Flacons à scintillation en PEHD | Fisher Scientific | 03-337-23B | Utiliser des flacons en PEHD pour la récupération quantitative des 3H2O |
| Rouge Bouchons à manchon en caoutchouc | Fisher Scientific | 14-126DD | Fit Flacons à scintillation de 20 ml ; Aiguille |
| réutilisable BD PrecisionGlide 23G x 40 mm | BD | 305194 | Permet d’injecter de l’acide perchlorique à travers le bouchon du manchon en caoutchouc du piège CO2 |
| Acide perchlorique, 60 | %Fisher Scientific | A228 | Hautement corrosif et peut agir comme un oxydant et/ou provoquer un risque d’explosion. Consulter la fiche signalétique du produit pour une manipulation et un stockage appropriés |
| Ultima Gold, Scintillation Cocktail | PerkinElmer | 6013327 | |
| Laine de verre | Fisher Scientific | AC38606 | |
| Decon Dri-Clean Détergent en poudre | Fisher Scientific | 04-355 | Pour le nettoyage de la verrerie, des pièces en plastique et des tubes |
| Alconox Tergazyme Détergent à énergie enzymatique | Fisher Scientifique | 16-000-115 | Pour le nettoyage des surfaces « difficiles d’accès » (tubes, verrerie) contaminées par des résidus d’acides gras-BSA |
Références
- Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
- Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signalin....
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Réimpressions et autorisations
