Visuelle kjemotakse analyser er viktig for en bedre forståelse av hvordan eukaryote celler styrer kjemotiltrekkende-mediert retnings celle migrasjon. Her beskriver vi detaljerte metoder for å: 1) real-time, høyoppløselig overvåking av flere chemotaxis analyser, og 2) samtidig visualisere kjemotiltrekkende gradient og tid og rom dynamikken i signaliserer hendelser i nøytrofil-lignende HL60 celler.
Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.
Eukaryote celler sanse og bevege seg mot høyere konsentrasjon innenfor et kjemoattraktant gradient, en mobil prosess omtalt som chemotaxis. Chemotaxis spiller viktige roller i mange fysiologiske prosesser, for eksempel embryogenese 1, nevron mønster 2, metastasering av kreft celler 3, rekruttering av nøytrofile til nettsteder på betennelse 4, og utviklingen av modellorganisme Dictyostelium discoideum 5. Generelt eukaryote celler avføle chemoattractants ved hjelp av G-protein-koblede reseptorer 5. Inngrepet av chemoattractants med disse reseptorene fremmer dissosiasjonen av de heterotrimeric G-proteiner Gα og Gβγ, som i sin tur aktiverer nedstrøms signaltransduksjonsveier som til slutt regulerer den tid og rom organiseringen av aktin cytoskjelettet å drive cellemigrering 5-9.
Celle biologer har vært å utvikle og forbedre chemotaxer analyser for å undersøke hvordan G protein-koblet reseptor (GPCR) signal- medierer rettet celle migrasjon. Boyden kammer eller transwell migrasjon analysen ble utviklet i 1960 av Boyden 10. Analysen fungerer ved å opprette en gradient av kjemoattraktant forbindelser mellom to brønner som er adskilt av en mikroporøs membran. Sin enkelhet og brukervennlighet gjør den til den mest brukte chemotaxis analysen til dags dato. Imidlertid analysen ikke tillater migrering prosessen av cellene som skal gjøres synlige. Den Zigmond kammeret er den første visuelle microfluidic enhet som gjør klar avbildning av celle migrasjon på et dekkglass over en smal innsnevring mot en kilde kjemotiltrekkende 11. Dunn 12 og Insall 13 modifisert og forbedret høy oppløsning og langsiktig bildebehandling evne zigmond kammer chemotaxis analysen. På grunn av den svært forutsigbare, diffusjon-dominant karakteristikk av strømning, har MicroFluidics vært å tilby løsninger for neste generasjon avpå kjemotakse analyser som EZ-TAXIScan (en celle mobilitets analyse-enhet).
Med stabiliteten av gradienten sikret, kan enheten seks kjemotaksis analyser kan utføres samtidig (figur 1A). I motsetning til de retningsbestemte gradienter som genereres i de forskjellige kammer analysene ovenfor, nålen eller mikropipette assay utviklet av Guenther Gerisch genererer en gradient med en bevegelig kilde 14. I analysen blir kjemotiltrekkende frigjøres fra en bevegelig mikropipette for å generere en stabil gradient. Med denne nålen analysen, fant forskerne at ulike celler generere pseudopods med fundamentalt forskjellige egenskaper. Bruk av fluoriserende mikroskopi, var vi i stand til å visualisere gradient for å lette sin kvantitativ måling hele 15. I denne studien, beskriver vi detaljerte fremgangsmåter for fremstilling av kjemotaktisk HL60 (human promyelocytisk leukemi-celler), samtidig overvåkning av flere kjemotakse assays med celle mobilitet analyseringsenheten, og visualisering av GPCR-formidlede tid og rom dynamikken til signaliseringsmolekyler som protein kinase D1 i enkelt levende celler i respons til synlige, spatiotemporally styr kjemotiltrekkende stimuli. De avanserte bildemetoder kan anvendes til generelle kjemotaksis studier, og er spesielt egnet for pattedyrcellesystemer.
I den foreliggende undersøkelse, viser vi to eksempler på kjemotaksi assays: For det første, samtidig overvåking av flere chemotaxis analyser av cellemobilitet analyseringsenheten; og andre, visualisering av kjemoattraktant gradient og tid og rom dynamikken i signaliserer hendelser i de samme cellene i sanntid.
Celle mobilitet analyse anordning for flere samtidige kjemotaksi assays
I denne studien, innførte vi en detaljert protokoll for å utføre flere samtidige Chemotaxis analyser ved hjelp av en celle mobilitet analyse enhet. Denne enheten tillater brukeren å observere cellulære kjemotaksishemmende atferd med en 10X objektiv i vanlig lys-feltet observasjon. På grunn av diffusjon-dominerende egenskapene til fluidstrømmen, frembringer cellen mobilitet analyseringsenheten svært forutsigbare og stabile gradienter og tillater opp til seks kjemotakse analyser som skal utføres samtidig. De kritiske trinnene i protokollenå få pålitelige gradienter og å justere cellene på terrassen linjen. Brukeren bør strengt følge produsentens instruksjoner for innehaveren montering og injeksjon av chemoattractants og celler. Detaljerte instruksjoner er også tilgjengelig på nettet. Sammenlignet med alternative metoder kjemotaksis 11-13,15, forbedrer denne enheten i betydelig grad påliteligheten og effektiviteten av kjemotakse analyser. Fire størrelser av cellemobilitet analyseringsenheten chip i størrelser på 4, 5, 6, og 8 um er tilgjengelige for å imøtekomme ulike typer og størrelser av celler. Vi har funnet at en 4 eller 5 um cellemobilitet analyseringsenheten brikken er egnet for HL60 og D. discoideum celler, som er omtrent 10-15 pm i diameter. Imidlertid er en begrensning at denne anordningen er ikke egnet for alle typer celler. Vi hadde lite suksess med mobil mobilitet analyse enhet chemotaxis analysen med Raw267.4 celler. Årsaken kan være at Raw267.4 celler migrerer for sakte. Den tid som kreves for effektiv chemotaxis av Raw267.4 celler kan være mye lenger enn den tiden en gradient blir vedlikeholdt av enheten. I stedet, en transwell migrasjon analysen jobbet godt for Raw267.4 celler 9. En annen begrensning er at fluoriserende observasjon er ikke mulig med den aktuelle enheten. En fremtidig retning er å overvåke fluorescerende avbildning med høyere forstørrelse. Dette er mulig med den forbedrede cellemobilitet analyseringsenheten, som er utstyrt med fluorescerende påvisning og en 100X objektivlinse. I tillegg er antallet samtidige assays også øket til 12. Alle disse forbedringene lette den forbedrede gjennomstrømningen av kjemotaksis analyser og observasjon av subcellulære dynamikk i migrerende celler.
Høy transfeksjonseffektivitet av HL60-celler til å uttrykke fluorescerende protein-protein merket
HL60-celler er en aktivt delende leukemicellelinje og vokse i suspensjon. Som tidligere rapportert 18-20, HL60-celler som er resistente mot gene overføring. Både lipid og elektroporasjon genoverføring er testet, og høyere transfeksjonseffektiviteten ble oppnådd med elektroporering, som beskrevet i detalj i seksjon 4. Skaffe høy levedyktighet etter elektroporasjon er kritisk for å oppnå høy transfeksjonseffektivitet på grunn av den alvorlige skade som stammer fra elektroporering. Deretter blir grundig og skånsom celle i søpla, spesielt etter electroporation. Alle medier må være forvarmet og forsiktig lagt til cellene i noen skritt etter electroporation. Det er også viktig å minimalisere eksponeringstiden av celler til elektroporering reagens. For å unngå celledød, etter elektroporering, RPMI 1640 elektroporering utvinning middel skal tilsettes til cellene umiddelbart. Vi fant at 20% FBS i utvinning medium gir en mye høyere celle utvinningsgrad enn 10% FBS. Etter elektroporering, er kritisk for økt levedyktighet og transfeksjon inkubering i RPMI 1640 medium electroporation gjenvinning i 30 mineffektivitet. For ytterligere å øke transfeksjonseffektiviteten, vi også brukt 4 ug plasmid-DNA pr transfeksjon, som er nesten to ganger mengden av plasmid som anbefales av produsenten.
Det er to viktige begrensninger på elektroporering transfeksjon: den transiency av protein ekspresjon og celletallet Grense (2 x 10 6 celler pr transfeksjon). I udifferensierte celler, er uttrykket påvises bare i løpet av den første par av celledelinger, ettersom vektorplasmidet fortynnes med halvparten etter hver celledeling. For differensiert HL60 celler overlever ikke mer enn 48 timer. Som et resultat, må en hvilken som helst eksperiment ferske trans 6 timer før forsøket. Cellen nummer for en electroporation møter bare minstekravet for eventuelle biokjemiske analyser. For hensikten med repeterende bruk eller store mengder, er det sterkt anbefalt at en udifferensiert HL60 cellelinje etableres som stabilt uttrykker proteinet av interesse WHIch har blitt merket med en fluorescerende protein av en viral vektor, hvis en viral vektor er tilgjengelig, eller kan konstrueres.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.
RPMI 1640 Medium GlutaMAX | Life technologies | 61870-036 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scietific | 11360-070 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
1M HEPES sterile solution, pH7.3 | Quality Biological Inc. | A611-J848-06 | |
Penicillin streptomycin solution | Fisher Scientific | 15140122 | |
NucleofectorTM 2b | Lonza | AAB-1001 | |
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes | Lonza | VCA-1003 | |
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
2 % Gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) | Life technologies | 14025-076 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3803 | |
Single well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155361 | |
Four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-10438 | |
fMLP | Sigma -Aldrich | F3506-5MG | |
Cover glass thickness 2 22 x 22 mm | Corning | 2855-22 | |
EZ-TAXIScan | Effector Cell Institute, Inc. | MIC-1001 | |
EZ-TAXIScan chip (5 mm) | Effector Cell Institute, Inc. | EZT-F01-5 | |
1701RN 10ul syringe | Hamilton | 80030 | |
Femtotips II Injection tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | |
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids. | Eppendorf | 5188900056 | |
DIAS software | Solltech Inc. | ||
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | Carl Zeiss |