Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll akuten Skelettmuskelregeneration in erwachsenen Mäusen und nachfolgende Manipulationen der Muskeln zu induzieren, wie Dissektion, Einfrieren, Schneiden, Routine-Färbung und myofiber Querschnittsfläche Analyse.
Abstract
Skelettmuskelregeneration ist ein physiologischer Prozess, der in der Erwachsenenskelettmuskeln in Reaktion auf eine Verletzung oder Erkrankung auftritt. Akute Verletzungen induzierte Skelettmuskelregeneration ist eine weit verbreitete, leistungsfähiges Modellsystem die Ereignisse in der Regeneration der Muskulatur sowie die Mechanismen und andere Akteure zu studieren. Tatsächlich ist eine genaue Kenntnis dieses Prozesses wichtig für ein besseres Verständnis der pathologischen Zustände, die Skelettmuskeldegeneration führen, und es hilft bei der neuen gezielte Therapiestrategien zu identifizieren. Die vorliegende Arbeit beschreibt eine detaillierte und reproduzierbare Protokoll akute Regeneration der Skelettmuskulatur bei Mäusen durch eine einzige intramuskuläre Injektion von Cardio (CTX) zu induzieren. CTX, gehört zur Familie der Toxine venom snake und verursacht Myolyse von Muskelfasern, die schließlich die Regenerationsereignisse auslöst. Die Dynamik der Skelettmuskelregeneration wird durch histologische Analyse von Muskelpartien ausgewertet. Das Protokoll auchzeigt die experimentellen Verfahren zum Präparieren, Einfrieren und die Tibialis Anterior Muskel, sowie die Routine Hämatoxylin & Eosin-Färbung Schneiden, die häufig für nachfolgende morphologische und morphometrische Analyse verwendet wird.
Introduction
Mammalian erwachsenen Skelettmuskeln werden durch Gruppen von Heften von mehrkernigen Muskelzellen (Muskelfasern) gebildet, die für die Kontraktion spezialisiert sind. Jede myofiber ist ein längliches Syncytium, durch die Sarkolemm (plasmatische Membran) umgeben und enthaltend Myofibrillen, die aus regelmäßig und wiederholt organisiert kontraktilen Proteine (Aktin und Myosin-Filamente) hergestellt sind. Im Erwachsenenleben und Ruhebedingungen, haben die Skelettmuskulatur eine sehr geringe Fluktuation ihrer myonuclei 1; Tatsächlich sind die myonuclei, die an der Peripherie des myofiber angeordnet sind, unter dem Sarkolemm, sind in der G0 – Phase des Zellzyklus arretiert und sind unfähig 1,2 zu proliferieren.
Skelettmuskeln haben die besondere Fähigkeit, nach einer Schädigung zu regenerieren, nach mehreren Ereignissen Geweberemodellierung Erreichen Homöostase, die miteinander fest verbunden sind. Nach einer akuten Verletzung oder ein Trauma wird Degeneration durch Regenerationsprozesse induziert, gefolgtdie verschiedenen Zellpopulationen beteiligt, einer Wohnbevölkerung von Muskelzellen einschließlich, die Satellitenzellen (SCs). Tatsächlich in Abwesenheit jeglicher Reize aus der Umwelt sind die Satellitenzellen in einem Ruhezustand und in einer Nische zwischen dem sarcolemma und der Basalmembran 3,4 liegt. Nach einer Verletzung oder Krankheit, aktiviert SCs werden, vermehren sich , wandern in die beschädigten Bereiche und schließlich unterscheiden, was zu neu bildenden Muskelfasern 5. Aktivierte SCs etablieren Cross-Talk mit verschiedenen Zellpopulationen, vor allem Entzündungszellen, die 6-8 in der Stelle des Traumas rekrutiert werden. Dieses Übersprechen ermöglicht es den Zellen einen geregelten Paradigma folgen , durch welche molekularen Signale strukturelle Modifikationen fahren, schließlich 9 bis Homöostase führt. Neben SCs, Entzündungs- und interstitiellen Zellen, angiogene Prozesse und Reinnervation Ereignisse sind ebenfalls beteiligt, in koordinierter Weise wirken diese hoch organisiert zu reparieren und specialized Struktur.
Es besteht großes Interesse verschiedene Aspekte der Skelettmuskelregeneration bei der Untersuchung, nicht nur die Physiologie des Muskels zu verstehen, sondern auch therapeutische Strategien zu verbessern, die tiefere Kenntnis des gesamten Prozesses erfordern. Mehrere experimentelle Ansätze sind derzeit beteiligt, die Identität und Funktion der verschiedenen Zellpopulationen, die Signalwege, und die molekularen Mechanismen zu untersuchen. Mausmodellen der akuten Verletzung stellen ein leistungsfähiges Werkzeug viele Aspekte dieses Prozesses zu untersuchen. Verschiedene Techniken , die üblicherweise verwendet , um akute Muskelschädigung zu induzieren den Forschern ermöglichen , den Regenerationsprozess in vivo zu folgen, von den sehr frühen Stadien bis zum Ende des Prozesses. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte von der intramuskulären Injektion von Schlangengift abgeleitetes Cardio (CTX), die Myolyse und löst den Regenerationsprozess induziert, bis zur Analyse von Gewebeproben. Nach CTX Injektion, mice kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten je nach Versuchsanforderungen geopfert werden, und die Skelettmuskeln können für die weitere Analyse herausgeschnitten und bearbeitet. Schließlich beschreiben wir das Färbungsprotokoll von Gewebeschnitten auf morphologische Beobachtungen und grundlegende quantitative Analysen durchführen. Dieses Protokoll ermöglicht die Studie der akuten Skelettmuskelregeneration in vivo in einer sehr reproduzierbar 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll akuten Verletzungen der Skelettmuskulatur zu induzieren (dh die intramuskuläre Injektion von CTX). Es ist weithin als ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Dynamik von Skelettmuskelregeneration in vivo verwendet. CTX Injektion induziert die Degeneration von Muskelfasern, die durch die Depolarisation des Sarkolemm und die Kontraktion der Fasern 12 und löst die Kaskade von Ereignissen verursacht wird , die zu Muskelregeneration führt. Skelettmuskeln…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
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