Induktion af akut Skeletal Muscle Regeneration af cardiotoxin Injection
Summary
Dette håndskrift beskriver en detaljeret protokol til at fremkalde akut skeletmuskulatur regenerering i voksne mus og efterfølgende manipulationer af de muskler, såsom dissektion, frysning, opskæring, rutinemæssige farvning og myofiber tværsnitsareal analyse.
Abstract
Skeletal muscle regeneration er en fysiologisk proces, der forekommer hos voksne skeletmuskler som respons på skade eller sygdom. Akut skade-inducerede skeletmuskel regenerering er et meget anvendt, kraftfuld modelsystem til at studere de begivenheder, der er involveret i muskel regenerering samt de mekanismer og forskellige aktører. Faktisk et detaljeret kendskab til denne proces er afgørende for en bedre forståelse af de patologiske tilstande, der fører til skeletmuskulaturen degeneration, og det hjælper med at identificere nye målrettede terapeutiske strategier. Den nuværende arbejde beskriver et detaljeret og reproducerbar protokol for at fremkalde akut skeletmuskulatur regenerering i mus gennem en enkelt intramuskulær injektion af cardiotoxin (CTX). CTX hører til familien af slangegift toksiner og forårsager myolyse af myofibre, som i sidste ende udløser regenerering begivenheder. Dynamikken i skeletmuskulatur regenerering vurderes ved histologisk analyse af muskel sektioner. Protokollen ogsåillustrerer de eksperimentelle procedurer for dissekering, frysning, og skære tibialis anterior muskel, samt den rutinemæssige Hematoxylin & Eosin-farvning, der er almindeligt anvendt til efterfølgende morfologisk og morfometrisk analyse.
Introduction
Pattedyr voksne skeletmuskulatur dannes af grupper af fascicules af flerkernede muskelceller (myofibre), som er specialiseret til sammentrækning. Hver myofiber er en aflang syncytium, omgivet af sarcolemma (plasma membran) og indeholder myofibriller, som består af regelmæssigt og gentagne gange organiserede kontraktile proteiner (actin og myosin filamenter). I voksenlivet og i hviletilstande, skeletmuskler har en meget lav omsætning på deres myonuclei 1; Faktisk er de myonuclei, som er placeret ved periferien af den myofiber, under sarcolemma, arresteres i G0-fasen af cellens cyklus, og er ude af stand til at proliferere 1,2.
Skeletmuskler har den ejendommelige evne til at regenerere efter skade, og nåede homøostase efter flere begivenheder af vævsombygning, der er tæt knyttet til hinanden. Efter en akut skade eller traume, er degeneration induceret, efterfulgt af regenereringsprocesserneder involverer forskellige cellepopulationer, herunder en fastboende befolkning i muskelceller, satellit celler (SCS). Faktisk, i mangel af miljømæssige stimuli, satellit celler er i en hviletilstand og er placeret i en specialiseret niche mellem sarcolemma og den basale lamina 3,4. Efter en skade eller sygdom, SCs bliver aktiveret, formere sig, migrere til de ødelagte områder, og i sidste ende differentiere, hvilket giver anledning til nyligt danner myofibre 5. Aktiverede SC'er etablere krydstale med forskellige cellepopulationer, primært inflammatoriske celler, der er rekrutteret i stedet med traume 6-8. Denne krydstale tillader cellerne at følge et reguleret paradigme, hvorved molekylære signaler drev strukturelle modifikationer, sidste ende fører til homeostase 9. Udover SCs, inflammatoriske og interstitielle celler, angiogene processer, og re-innervation begivenheder er også involveret, handler på en koordineret måde for at reparere denne meget organiseret og specialized struktur.
Der er stor interesse i at studere forskellige aspekter af skeletmuskulatur regenerering, ikke kun for at forstå fysiologi af musklen, men også at forbedre terapeutiske strategier, der kræver større kendskab til hele processen. Adskillige eksperimentelle tilgange er i øjeblikket tilgængelige til at studere identiteten og funktionen af de forskellige cellepopulationer, signalvejene og de molekylære mekanismer, der er involveret. Musemodeller for akut skade et virksomt middel til at undersøge mange aspekter af denne proces. Forskellige almindeligt anvendte teknikker til at inducere akut muskelskade forskerne mulighed for at følge regenereringsprocessen in vivo, fra de tidlige stadier til slutningen af processen. Denne protokol beskriver de trin fra intramuskulær injektion af slangegift-afledt cardiotoksin (CTX), der inducerer myolyse og udløser regenerering processen op til en analyse af vævsprøver. Efter CTX injektion, mice kan aflivet på forskellige tidspunkter afhængig af eksperimentelle krav og skeletmuskulatur kan dissekeret og forarbejdet til yderligere analyse. Endelig beskriver vi farvningen protokollen af vævssnit til at udføre morfologiske observationer og grundlæggende kvantitative analyser. Denne protokol muliggør studiet af akut skeletmuskel regenerering in vivo i en meget reproducerbar måde 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en protokol til at fremkalde akut skade i skeletmuskulatur (dvs. intramuskulær injektion af CTX). Det er almindeligt anvendt som et effektivt værktøj til at studere dynamikken i skeletmuskulatur regeneration in vivo. CTX injektion inducerer degeneration af muskelfibre, som er forårsaget af depolarisering af sarcolemma og sammentrækning af fibrene 12, og udløser den kaskade af begivenheder, der fører til muskel regenerering. Skeletmuskler dissekeres på ønskede tidspu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
References
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
- Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
- Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
- Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7 (2014).
