心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導
Summary
この原稿は、成体マウスや、解剖などの筋肉のその後の操作、凍結、切断、ルーチン染色、および筋線維断面積の解析における急性骨格筋再生を誘導するための詳細なプロトコルを記述します。
Abstract
骨格筋再生は、損傷または疾患に応じて、成人骨格筋に発生する生理学的プロセスです。急性損傷誘導骨格筋再生は筋肉の再生に関与するイベントだけでなく、メカニズムと異なる選手を研究するために広く使用されている、強力なモデル系です。実際には、このプロセスの詳細な知識は、骨格筋の変性につながる病的状態をより良く理解するために不可欠であり、それは新たな標的治療戦略を同定するのに役立ちます。本研究は、心臓毒の単回筋肉内注射（CTX）を介して、マウスにおける急性骨格筋再生を誘導するための詳細と再現性のプロトコルについて説明します。 CTXは、ヘビ毒毒素のファミリーに属し、最終的には再生イベントをトリガ筋線維の筋変性を引き起こします。骨格筋再生のダイナミクスは、筋肉切片の組織学的分析によって評価されます。また、プロトコル、解剖凍結、および前脛骨筋だけでなく、広くその後の形態学的および形態計測分析のために使用されるルーチンのヘマトキシリン＆エオシン染色を切断するための実験手順を示しています。
Introduction
哺乳類の成体の骨格筋が収縮するために特化して多核筋細胞（筋線維）のfasciculesのグループによって形成されています。各筋線維は、筋細胞膜（原形質膜）に囲まれた、細長い合胞体であり、定期的に繰り返し編成収縮タンパク質（アクチンとミオシンフィラメント）で構成されている筋原繊維を含みます。大人の生活の中で、および休止状態で、骨格筋は、彼らの筋核1の非常に低い離職率を持っています。確かに、筋線維の周囲に位置している筋核は、筋細胞膜の下で、細胞周期のG0期で停止し、1,2を増殖することはできませんされています。
骨格筋は、互いに緊密に関連している組織リモデリングのいくつかのイベントの後ホメオスタシスに達し、次のダメージを再生する独特の能力を有します。急性損傷または外傷後、変性は、誘導される再生過程が続きますすなわち、筋細胞、衛星細胞（SCS）の居住集団を含む異なる細胞集団を含みます。実際、任意の環境刺激の非存在下では、衛星細胞は静止状態にあり、筋細胞膜と基底板3,4の間に特殊なニッチに位置しています。怪我や病気に続いて、SCが、活性化、増殖、損傷領域に移行し、最終的に分化し、新たに筋線維5を形成を生じます。活性化のSCは、異なる細胞集団で外傷6-8のサイトで募集されている主に炎症細胞を、クロストークを確立します。このクロストークは、細胞が分子シグナルが最終的ホメオスタシス9につながる、構造的修飾を駆動することによって調整されたパラダイムに従うことができます。 SC、炎症および間質細胞、血管形成過程、および再神経支配のイベントの他にも、この高度に組織とsを修復するために協調的に作用し、関与していますpecialized構造。
筋肉の生理学を理解するだけでなく、プロセス全体のより深い知識を必要とする治療戦略を改善するだけでなく、骨格筋再生のさまざまな側面を研究することに大きな関心があります。いくつかの実験的アプローチは、現在、異なる細胞集団、シグナル伝達経路、および関与する分子メカニズムのアイデンティティと機能を研究するために利用可能です。急性の傷害のマウスモデルは、このプロセスの多くの側面を研究するための強力なツールを表します。研究者は非常に早い段階からプロセスの最後に、 インビボでの再生プロセスに従うことができるように、急性筋損傷を誘発する別の一般的に使用される技術。このプロトコルは、筋変性を誘導し、組織サンプルの分析まで、再生処理をトリガするヘビ毒由来の心臓毒（CTX）の筋肉内注射からの手順を説明します。 CTXの注射後、MICEは、実験の要件に応じて異なる時点で犠牲にすることができ、骨格筋を解剖し、さらなる分析のために処理することができます。最後に、我々は、形態学的観察結果と基本的な定量分析を行うための組織切片の染色プロトコルを記述する。このプロトコルは、非常に再現性のある方法10のin vivoでの急性骨格筋再生の研究を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、骨格筋（ すなわち、CTXの筋肉注射）での急性損傷を誘導するためのプロトコルを記述します。これは、 インビボでの骨格筋再生のダイナミクスを研究するための強力なツールとして広く用いられています。 CTX注入は筋細胞膜の脱分極および繊維12の収縮によって引き起こされる筋線維の変性を誘導し、筋肉の再生につながる事象のカスケードを誘発します。…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
References
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