Induksjon av akutt Skeletal Muscle Regenerering av Cardiotoxin Injection
Summary
Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for å indusere akutt skjelett-muskel regenerering i voksne mus og etterfølgende manipulasjoner av muskler, såsom disseksjon, frysing, skjæring, rutine flekker, og myofiber tverrsnittsareal analyse.
Abstract
Skjelettmuskulatur regenerering er en fysiologisk prosess som forekommer hos voksne skjelettmuskulaturen som respons på skade eller sykdom. Akutt skade-indusert skjelettmuskulatur gjenfødelse er et mye brukt, kraftig modellsystem for å studere hendelser som er involvert i muskel regenerasjon samt mekanismer og ulike aktører. Faktisk en detaljert kunnskap om denne prosessen er avgjørende for en bedre forståelse av patologiske tilstander som fører til skjelettmuskulatur degenerasjon, og det bidrar i å identifisere nye målrettede terapeutiske strategier. Dette arbeidet beskriver en detaljert og reproduserbar protokollen for å indusere akutt skjelettmuskulatur regenerering hos mus gjennom en enkelt intramuskulær injeksjon av Cardiotoxin (CTX). CTX tilhører familien av slangegift toksiner og fører myolyse av myofibers, som til slutt utløser regenerering hendelser. Dynamikken i skjelettmuskulatur regenerering evalueres ved histologisk analyse av muskel seksjoner. Protokollen ogsåillustrerer de eksperimentelle prosedyrene for å dissekere, frysing, og kutting av tibialis anterior muskel, så vel som rutinemessig Hematoxylin-eosin-farging som er mye brukt for etterfølgende morfologisk og morfometrisk analyse.
Introduction
Pattedyr voksne skjelettmuskulatur er dannet av grupper av fascicules av multinucleated muskelceller (myofibers) som er spesialisert for sammentrekning. Hver myofiber er et langstrakt syncytium, omgitt av sarcolemma (plasmamembran) og inneholder myofibrils, som er tatt opp av regelmessig og gjentatte ganger organiserte kontraktile proteiner (aktin og myosin filamenter). I voksen livet og i hvilebetingelser, skjelettmuskulatur har en svært lav omsetning på deres myonuclei 1; ja, de myonuclei, som er plassert ved periferien av den myofiber, under sarcolemma, blir arrestert i G0-fasen av cellesyklusen, og er ute av stand til å formere seg 1,2.
Skjelettmuskler har den eiendommelige evne til å regenerere etter skade, og nådde homeostase etter flere hendelsene i vev-omforming som er tett forbundet med hverandre. Etter å ha en akutt skade eller traume, blir indusert degenerering, etterfulgt av regenereringsprosessersom involverer ulike cellepopulasjoner, inkludert en fastboende befolkning på muskelcellene, satellittceller (SCS). Faktisk, i fravær av miljømessige stimuli, satellitt cellene er i en hviletilstand og er plassert i en nisje mellom sarcolemma og basal lamina 3,4. Etter en skade eller sykdom, SC'er blir aktivert, spre seg, migrere til de skadede områdene, og til slutt skille, noe som gir opphav til nye forming myofibers 5. Aktivert SC'er etablere krysstale med forskjellige cellepopulasjoner, hovedsakelig betennelsesceller, som er rekruttert i stedet for traumer 6-8. Dette cross-talk gjør at cellene til å følge et regulert paradigme der molekylære signaler drive strukturelle endringer, til slutt fører til homeostase 9. Foruten SC'er, provoserende og interstitielle celler, angiogeneprosesser, og re-innerverte hendelser er også involvert, opptrer på en samordnet måte å reparere dette svært organisert og specialized struktur.
Det er stor interesse for å studere ulike aspekter av skjelettmuskulatur regenerering, ikke bare for å forstå fysiologien i muskler, men også for å bedre terapeutiske strategier som krever dypere kunnskap om hele prosessen. Flere eksperimentelle tilnærminger er for tiden tilgjengelig for å studere identitet og funksjon av de forskjellige cellepopulasjoner, de signalveier, og de molekylære mekanismene som er involvert. Musemodeller av akutt skade representerer et kraftig verktøy for å undersøke mange aspekter av denne prosessen. Forskjellige teknikker som vanligvis brukes for å indusere akutt muskelskader tillate forskere å følge regenereringsprosessen in vivo, fra de meget tidlige stadiene til slutten av prosessen. Denne protokollen beskriver trinnene fra intramuskulær injeksjon av slangegift-avledet Cardiotoxin (CTX), som induserer myolyse og utløser regenereringen opp til analyse av vevsprøver. Etter CTX injeksjon, mice kan bli ofret ved ulike tidspunkt avhengig av eksperimentelle krav og skjelettmusklene kan dissekert og behandles for videre analyse. Til slutt beskriver vi farging protokollen av vevssnitt å utføre morfologiske observasjoner og grunnleggende kvantitative analyser. Denne protokollen tillater studiet av akutt skjelettmuskulatur regenerering in vivo i en meget reproduserbar måte 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en protokoll for å indusere akutt skade i muskulaturen (dvs. intramuskulær injeksjon av CTX). Den er mye brukt som et kraftig verktøy for å studere dynamikken i skjelettmuskulatur regenerering in vivo. CTX injeksjon induserer degenerering av muskelfibre, som er forårsaket av depolarisering av sarcolemma og sammentrekning av fibrene 12, og utløser den kaskade av hendelser som fører til muskel regenerering. Skjelettmuskulatur dissekeres på ønskede tidspunkter etter in…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
References
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
- Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
- Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
- Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7 (2014).
