Индукция Острый скелетных мышц регенерации путем инъекций Cardiotoxin
Summary
Эта рукопись описывает подробный протокол, чтобы вызвать острый скелетной регенерации мышц у взрослых мышей и последующих манипуляций мышц, таких как рассечение, замораживание, разделка, рутинного окрашивания и мышечное волокно поперечного сечения анализа площади.
Abstract
Скелетная регенерации мышц является физиологическим процессом, который происходит у взрослых скелетных мышц в ответ на повреждение или болезнь. Острая травма индуцированных скелетных мышц регенерации является широко используемым, мощная модель системы для изучения событий, участвующих в регенерации мышц, а также механизмов и различных игроков. Действительно, детальное знание этого процесса имеет важное значение для лучшего понимания патологических состояний, которые приводят к скелетной мышечной дегенерацией, и это помогает в определении новых целевых терапевтических стратегий. Настоящая работа описывает подробную и воспроизводимый протокол, чтобы вызвать острый скелетной регенерации мышц у мышей через одну внутримышечной инъекции cardiotoxin (CTX). CTX принадлежит к семейству змеиного яда токсинов и вызывает миолиза из мышечных волокон, которые в конечном итоге вызывает события регенерации. Динамика скелетной мышечной регенерации оценивали с помощью гистологического анализа срезов мышц. Протокол такжеиллюстрирует экспериментальные процедуры вскрытия, замораживания и сокращения мышц передней большеберцовой, а также рутинное окрашивание Hematoxylin и эозином, который широко используется для последующего морфологического и морфометрического анализа.
Introduction
Млекопитающим взрослых скелетных мышц образуются группами fascicules многоядерные мышечные клетки (миофибриллы), которые являются специализированными для сокращения. Каждый мышечное волокно представляет собой продолговатый синцитиально, окруженный сарколеммой (плазматической мембраны) и содержащие миофибрилл, которые состоят из регулярно и многократно организованных сократительных белков (актина и миозина). Во взрослой жизни и в состоянии покоя, скелетные мышцы имеют очень низкий оборот их миоядер 1; В самом деле, миоядер, которые расположены на периферии мышечное волокно, под сарколемму, арестовываются в фазе G0 клеточного цикла и не способны пролиферировать 1,2.
Скелетные мышцы имеют своеобразную способность регенерировать после повреждения, достигая гомеостаза после нескольких событий ремоделирование тканей, которые тесно связаны друг с другом. После острого повреждения или травмы, дегенерации индуцируется, с последующим процессам регенерациикоторые включают различные клеточные популяции, в том числе постоянного населения мышечных клеток, сателлитные клетки (SCS). Действительно, при отсутствии каких – либо внешних стимулов, сателлитные клетки находятся в состоянии покоя и расположены в специализированной нише между сарколеммой и базальной пластинки 3,4. После травмы или болезни, ГКС активизируются, пролиферируют, мигрируют в поврежденные участки, и в конечном итоге дифференцироваться, давая начало формирующихся миофибрилл 5. Активированные Стволовые установить перекрестные помехи с различных клеточных популяций, в основном воспалительные клетки, которые набираются в месте травмы 6-8. Это наводок позволяет клеткам следовать регулируемую парадигму , с помощью которых молекулярные сигналов возбуждения структурных изменений, в конечном итоге приводит к гомеостаза 9. Кроме того, ГКС, воспалительных и интерстициальных клеток, кровеносных сосудов процессов, а также повторно иннервации событий также участвуют, действуя согласованно, чтобы исправить это высокоорганизованная и SСтруктура специализированном.
Существует большой интерес к изучению различных аспектов скелетной мышечной регенерации, не только понять физиологию мышцы, но и улучшить терапевтические стратегии, которые требуют более глубокого знания всего процесса. Несколько экспериментальных подходов в настоящее время доступны для изучения личности и функции различных клеточных популяций, сигнальных путей и молекулярных механизмов, участвующих. Мышиные модели острого повреждения представляют собой мощный инструмент для исследования многих аспектов этого процесса. Различные часто используемые методы , чтобы вызвать острое повреждение мышц позволяют исследователям следить за процессом регенерации в естественных условиях, от самых ранних этапов до конца процесса. Этот протокол описывает шаги из внутримышечной инъекции змеиного яда-производного cardiotoxin (CTX), который вызывает миолиза и запускает процесс регенерации, вплоть до анализа образцов ткани. После CTX инъекции, милиCE может быть принесена в жертву в различные моменты времени в зависимости от экспериментальных условий, а скелетные мышцы могут быть разрезаны и обработаны для дальнейшего анализа. Наконец, мы опишем протокол окрашивания срезов тканей для выполнения морфологических наблюдений и основные количественные анализы. Этот протокол позволяет для исследования острой скелетной мышечной регенерации в естественных условиях в высокой воспроизводимостью 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем протокол , чтобы вызвать острое поражение в скелетных мышцах (например, внутримышечной инъекции CTX). Он широко используется в качестве мощного инструмента для изучения динамики скелетной мышечной регенерации в естественных условиях. СТХ инъекция индуцирует д?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
References
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
- Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
- Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
- Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7 (2014).
