La inducción de la regeneración muscular esquelético aguda por inyección Cardiotoxin
Summary
Este manuscrito describe un protocolo detallado para inducir la regeneración del músculo esquelético aguda en ratones adultos y posteriores manipulaciones de los músculos, tales como disección, congelación, corte, tinción de rutina, y miofibras análisis del área de la sección transversal.
Abstract
la regeneración del músculo esquelético es un proceso fisiológico que se produce en los músculos esqueléticos adultos en respuesta a una lesión o enfermedad. la regeneración del músculo esquelético inducida por la lesión aguda es un sistema poderoso modelo ampliamente utilizado para estudiar los eventos involucrados en la regeneración muscular, así como los mecanismos y diferentes jugadores. De hecho, un conocimiento detallado de este proceso es esencial para una mejor comprensión de las condiciones patológicas que conducen a la degeneración del músculo esquelético, y que ayuda en la identificación de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas. El presente trabajo describe un protocolo detallado y reproducible para inducir la regeneración del músculo esquelético aguda en ratones a través de una única inyección intramuscular de cardiotoxina (CTX). CTX pertenece a la familia de toxinas de veneno de serpiente y causa miólisis de miofibras, que finalmente desencadena los eventos de regeneración. La dinámica de la regeneración del músculo esquelético es evaluado por el análisis histológico de secciones de músculo. El protocolo tambiénilustra los procedimientos experimentales para la disección, la congelación, y cortar el músculo tibial anterior, así como la tinción con hematoxilina y eosina de rutina que se utiliza ampliamente para el análisis morfológico y morfométrico posterior.
Introduction
músculos esqueléticos adultos de mamíferos están formados por grupos de fascículos de las células musculares multinucleadas (miofibras) que se especializan para la contracción. Cada miofibrilar es un sincitio alargada, rodeada por el sarcolema (membrana plasmática) y miofibrillas que contienen, que se compone de proteínas contráctiles organizadas regular y repetidamente (actina y miosina filamentos). En la vida adulta y en condiciones de reposo, los músculos esqueléticos tienen una muy baja rotación de su mionúcleos 1; de hecho, los mionúcleos, que se encuentran en la periferia de la miofibras, bajo el sarcolema, son detenidas en la fase G0 del ciclo celular y son incapaces de proliferar 1,2.
Los músculos esqueléticos tienen la capacidad peculiar de regenerarse después del daño, llegando a homeostasis después de varios acontecimientos de remodelación de tejidos que están estrechamente relacionados entre sí. Después de una lesión aguda o trauma, se induce la degeneración, seguida por los procesos de regeneraciónque implican diferentes poblaciones de células, incluyendo una población residente de las células musculares, las células satélite (SCS). En efecto, en ausencia de cualquier estímulo ambientales, las células satélite están en un estado de reposo y se encuentran en un nicho especializado entre el sarcolema y el 3,4 lámina basal. Después de una lesión o enfermedad, SCs se activan, proliferan, migran a las zonas dañadas, y, finalmente, diferenciar, dando lugar a las miofibras de nueva formación 5. SC activados establecen diafonía con diferentes poblaciones de células, células inflamatorias, principalmente, que son reclutadas en el sitio del trauma 6-8. Esta diafonía permite que las células siguen un paradigma regulado por el cual las señales moleculares que conducen modificaciones estructurales, que finalmente llevan a la homeostasis 9. Además de las SC, células inflamatorias e intersticiales, procesos angiogénicos, y eventos de re-inervación también están involucrados, actuando de manera coordinada para reparar este altamente organizado y specialized estructura.
Hay un gran interés en el estudio de los diferentes aspectos de la regeneración del músculo esquelético, no sólo para entender la fisiología del músculo, pero también para mejorar las estrategias terapéuticas que requieren conocimiento más profundo de todo el proceso. Varios enfoques experimentales están disponibles actualmente para estudiar la identidad y la función de las diferentes poblaciones de células, las vías de señalización, y los mecanismos moleculares implicados. Los modelos de ratón de lesión aguda representan una herramienta poderosa para investigar muchos aspectos de este proceso. Diferentes usados comúnmente técnicas para inducir daño muscular aguda permiten a los investigadores siguen el proceso de regeneración in vivo, desde las primeras etapas hasta el final del proceso. Este protocolo describe los pasos de la inyección intramuscular de cardiotoxina derivada de veneno de serpiente (CTX), que induce miólisis y desencadena el proceso de regeneración, hasta el análisis de muestras de tejido. Después de la inyección CTX, mice puede ser sacrificada en diferentes puntos de tiempo dependiendo de las necesidades experimentales, y los músculos del esqueleto puede ser disecado y procesada para su posterior análisis. Finalmente, se describe el protocolo de tinción de secciones de tejido para realizar observaciones morfológicas y análisis cuantitativos básicos. Este protocolo permite el estudio de la regeneración del músculo esquelético aguda in vivo de una manera altamente reproducible 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
A continuación, se describe un protocolo para inducir una lesión aguda en el músculo esquelético (es decir, la inyección intramuscular de CTX). Es ampliamente utilizado como una herramienta poderosa para estudiar la dinámica de la regeneración del músculo esquelético in vivo. Inyección CTX induce la degeneración de las fibras musculares, que es causada por la despolarización de la sarcolema y la contracción de las fibras 12, y desencadena la cascada de eventos que conduce a la r…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
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