Induktion av akut Skeletal Muscle Regeneration av Cardiotoxin Injection
Summary
Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för att inducera akut skelettmuskulaturen förnyelse hos vuxna möss och efterföljande manipulationer av musklerna, såsom dissektion, frysning, skärning, rutin färgning och myofiber tvärsnittsarea analys.
Abstract
Skelettmuskelregenerering är en fysiologisk process som sker i vuxen skelettmuskler som svar på skada eller sjukdom. Akut skada-inducerad skelettmuskulaturen förnyelse är en allmänt använd, kraftfulla modellsystem för att studera de som är inblandade i muskelregenerering samt mekanismer och olika aktörer händelser. I själva verket är en detaljerad kunskap om denna process avgörande för en bättre förståelse av de patologiska tillstånd som leder till degeneration av skelettmuskulaturen, och det hjälper till att identifiera nya målinriktade terapeutiska strategier. Detta arbete beskriver en detaljerad och reproducerbar protokoll för att framkalla akut skelettmuskulaturen förnyelse i möss genom en enda intramuskulär injektion av cardiotoxin (CTX). CTX tillhör familjen av ormgift toxiner och orsakar myolys av myofibers, som så småningom utlöser regenereringshändelser. Dynamiken i skelettmuskelregenerering utvärderas genom histologisk analys av muskel sektioner. Protokollet ocksåillustrerar de experimentella förfarandena för att dissekera, frysning, och skära tibialis anterior, liksom rutinen Hematoxylin & Eosin färgning som ofta används för efterföljande morfologiska och morfometrisk analys.
Introduction
Däggdjur vuxna skelettmuskulaturen bildas av grupper av fascicules av flerkärniga muskelceller (myofibers) som är specialiserade för kontraktion. Varje myofiber är en långsträckt syncytium, omgiven av sarcolemma (plasmamembran) och innehåller myofibriller, som består av regelbundet och upprepade gånger organiserade kontraktila proteiner (aktin och myosin filament). I vuxenlivet och när man vilar, skelettmuskler har en mycket låg omsättning på sin myonuclei 1; sannerligen, myonuclei, som ligger i utkanten av myofiber under sarcolemma, arresteras i G0 fasen av cellcykeln och är oförmögna att föröka sig 1,2.
Skelettmuskler har den säregna förmåga att regenerera efter skada och nådde homeostas efter flera händelser av vävnadsombildning som är tätt kopplade till varandra. Efter en akut skada eller trauma är degeneration induceras, följt av regenereringsprocessersom involverar olika cellpopulationer, inklusive en bofast befolkning av muskelceller, satellitceller (SCS). I själva verket, i avsaknad av miljö stimuli, satellitceller i ett vilotillstånd och är belägna i en nisch mellan sarcolemma och basala lamina 3,4. Efter en skada eller sjukdom, SCS blir aktiverad, förökar sig, migrera till de skadade områdena, och så småningom differentiera, vilket ger upphov till nya bildar myofibers 5. Aktiverade kaster etablera överhörning med olika cellpopulationer, främst inflammatoriska celler, som rekryteras i stället för trauma 6-8. Detta överhörning gör att cellerna att följa ett reglerat paradigm genom vilka molekylära signaler medföra strukturella förändringar, så småningom leder till homeostas 9. Förutom SC, inflammatoriska och interstitiella celler, angiogena processer, och åter innervation händelser är också involverade, agerar på ett samordnat sätt för att reparera detta välorganiserad och specialized struktur.
Det finns ett stort intresse för att studera olika aspekter av skelettmuskulaturen förnyelse, inte bara för att förstå fysiologi muskler, men också för att förbättra behandlingsstrategier som kräver djupare kunskap om hela processen. Flera experimentella metoder är för närvarande tillgängliga för att studera identitet och funktion av de olika cellpopulationer, de signalvägar, och de molekylära mekanismer som är inblandade. Musmodeller av akuta skador representerar ett kraftfullt verktyg för att undersöka många aspekter av denna process. Olika vanligt förekommande tekniker för att framkalla akut muskelskada tillåta forskare att följa regenereringsprocessen in vivo, från mycket tidiga skeden till slutet av processen. Detta protokoll beskriver stegen från intramuskulär injektion av ormgift-härlett cardiotoxin (CTX), som inducerar myolys och utlöser regenereringsprocessen, fram till analys av vävnadsprover. Följande CTX injektion, mice kan offras vid olika tidpunkter beroende på experimentella krav, och skelettmuskulaturen kan dissekeras och bearbetades för ytterligare analys. Slutligen beskriver vi färgningsprotokollet av vävnadssnitt för att utföra morfologiska observationer och grundläggande kvantitativa analyser. Detta protokoll möjliggör studier av akut skelettmuskel förnyelse in vivo på ett mycket reproducerbart sätt 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för att framkalla akut skada i skelettmuskel (dvs intramuskulär injektion av CTX). Den används ofta som ett kraftfullt verktyg för att studera dynamiken i skelettmuskulaturen regenerering in vivo. CTX injektion inducerar degenerering av muskelfibrer, som orsakas av depolarisation av sarcolemma och sammandragning av fibrerna 12, och utlöser kaskad av händelser som leder till muskelregenerering. Skelettmuskulatur dissekeras vid önskade tidpunkter efter in…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
References
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
- Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
- Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
- Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7 (2014).
