में गहराई शारीरिक माउस vomeronasal अंग की तीव्र ऊतक स्लाइस में परिभाषित सेल आबादी के विश्लेषण
Summary
Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.
Abstract
In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.
Introduction
अधिकांश जानवरों को उनके रासायनिक इंद्रियों पर काफी भरोसा है अपने आसपास के साथ बातचीत करने के लिए। गंध की भावना को खोजने और भोजन का मूल्यांकन, शिकारियों से बचने और पता लगाने उपयुक्त संभोग भागीदारों के लिए एक आवश्यक भूमिका निभाता है। मुख्य घ्राण उपकला 1,2, 3,4 Grueneberg नाड़ीग्रन्थि, Masera 5,6 के सेप्टल अंग और Vomeronasal अंग: सबसे स्तनधारियों में, घ्राण प्रणाली में कम से कम चार संरचनात्मक और कार्यात्मक अलग परिधीय उप के होते हैं। VNO गौण घ्राण प्रणाली (AOS) है, जो रासायनिक संकेत है कि पहचान, लिंग, सामाजिक रैंक और यौन राज्य 7-10 बारे में जानकारी देने का पता लगाने में एक प्रमुख भूमिका निभाता के परिधीय संवेदी संरचना शामिल हैं। VNO सही तालू ऊपर नाक पट के आधार पर स्थित है। चूहों में, यह एक द्विपक्षीय अंधा न खत्म होने वाली एक उपास्थि कैप्सूल 11-13 में संलग्न ट्यूब है। अंग दोनों एक चंद्राकार औसत दर्जे का संवेदी epithe के होते हैंlium कि VSNs बंदरगाहों और पार्श्व पक्ष पर एक गैर-संवेदी भाग की। दोनों के बीच एक epithelia बलगम से भरे लुमेन जो संकीर्ण vomeronasal वाहिनी 14 के माध्यम से नाक गुहा से जुड़ा है निहित है। गैर-संवेदी ऊतकों में एक बड़े पार्श्व रक्त वाहिनियों की नकारात्मक दबाव 15,16 के माध्यम से ऐसे पेप्टाइड्स या VNO लुमेन में छोटे प्रोटीन के रूप में अपेक्षाकृत बड़े, ज्यादातर गैर अस्थिर अणुओं के प्रवेश की सुविधा के लिए एक संवहनी पंप तंत्र प्रदान करता है। VNO की संरचनात्मक घटकों जन्म के समय मौजूद हैं और अंग शीघ्र ही यौवन 17 से पहले वयस्क आकार तक पहुँचता है। हालांकि, कृंतक AOS पहले से किशोरों में कार्यात्मक है कि क्या अभी भी 18-20 बहस का विषय है।
VSNs दोनों अपने उपकला स्थान और रिसेप्टर के प्रकार वे एक्सप्रेस द्वारा प्रतिष्ठित हैं। VSNs एक बिना मेलिनकृत अक्षतंतु और एक भी शिखर डेन्ड्राइट कि लुमेन की ओर protrudes और एक microvillous वृक्ष के समान घुंडी में समाप्त होता है के साथ एक द्विध्रुवी आकृति विज्ञान दिखा। VSN कुल्हाड़ीons fasciculate vomeronasal तंत्रिका कि dorso दुम अंत में उपास्थि कैप्सूल छोड़ देता है, पट साथ ascends, cribriform प्लेट और गौण घ्राण बल्ब (एओबी) 21,22 करने के लिए परियोजनाओं गुजरता के रूप में। vomeronasal संवेदी उपकला दो परतों के होते हैं: शिखर परत ल्यूमिनल पक्ष और बंदरगाहों दोनों V1R- और सभी लेकिन न्यूरॉन्स FPR रु व्यक्त की एक प्रकार के करीब स्थित है। इन न्यूरॉन्स जी प्रोटीन α सबयूनिट जी αi2 और एओबी 23-25 के पूर्वकाल हिस्सा करने के लिए परियोजना coexpress। संवेदी अधिक बेसल परत एक्सप्रेस V2Rs या FPR-RS1 जी αo के साथ-साथ में स्थित न्यूरॉन्स और एओबी 26-28 के पीछे क्षेत्र के लिए उनकी एक्सोन भेजते हैं।
Vomeronasal न्यूरॉन्स की संभावना नहीं बल्कि छोटे semiochemicals 29-33 (V1Rs) या प्रोटीन यौगिकों 34-38 (V2Rs) कि इस तरह के मूत्र, लार के रूप में विभिन्न शारीरिक तरल पदार्थ में स्रावित तरल पदार्थ और आंसू रहे हैं द्वारा सक्रिय कर रहे हैं 37,39-41 </sup>। सीटू प्रयोगों में पता चला है कि VSNs भी formylated पेप्टाइड्स और विभिन्न रोगाणुरोधी / सूजन से जुड़े यौगिकों 25,42 से सक्रिय कर रहे हैं। इसके अलावा, heterologously व्यक्त FPR रु प्रोटीन प्रतिरक्षा प्रणाली में व्यक्त FPRs साथ एगोनिस्ट स्पेक्ट्रा का हिस्सा है, conspecifics या खराब खाना सूत्रों 25 में बीमारी के लिए डिटेक्टरों के रूप में एक संभावित भूमिका का संकेत (संदर्भित 43 देखें)।
विशिष्ट VSN आबादी में रिसेप्टर ligand रिश्तों को और नीचे की ओर cascades संकेत समझने के लिए मौलिक एक देशी वातावरण में अपने बुनियादी biophysical विशेषताओं का एक विस्तृत मूल्यांकन है। अतीत में, सेलुलर संकेत के विश्लेषण बहुत आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों है कि एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर 30,44-49 coexpressing द्वारा न्यूरॉन्स की एक परिभाषित आबादी के निशान से लाभान्वित किया है। इस प्रोटोकॉल में, एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन है कि एक साथ FPR-RS3 व्यक्त एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ (FPR-RS3-ए-शुक्र) का इस्तेमाल किया जाता है।यह दृष्टिकोण कैसे इस तरह के एक आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस तनाव को रोजगार के लिए एक ऑप्टिकली पहचाने जाने सेल तीव्र राज्याभिषेक VNO ऊतक स्लाइस में एक न्यूरॉन पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग आबादी के electrophysiological विश्लेषण करने के लिए एक मिसाल है। एक हवा के दबाव पर ही आधारित संवेदी उत्तेजनाओं और औषधीय एजेंटों के लिए मल्टी बैरल छिड़काव प्रणाली रिकॉर्डिंग के दौरान, जल्दी प्रतिवर्ती और फोकल न्यूरोनल उत्तेजना या निषेध की अनुमति देता है। टुकड़ा तैयारी में पूरे सेल रिकॉर्डिंग सेल के देशी वातावरण में आंतरिक गुणों, वोल्टेज सक्रिय conductances का एक विस्तृत विश्लेषण, साथ ही संभावित कार्रवाई मुक्ति पैटर्न के लिए अनुमति देते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
VNO एक chemosensory संरचना है कि semiochemicals का पता लगाता है। तिथि करने के लिए, vomeronasal रिसेप्टर्स के बहुमत के रूप में केवल कुछ रिसेप्टर ligand जोड़े पहचान की गई है deorphanized जाना बना रहता है। उन लोगों के बीच, V1rb2 वर्णित किया गया था पुर?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.
Materials
| Chemicals | |||
| Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
| ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Surgical tools and consumables | |||
| Large petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
| Small petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
| Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
| Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
| Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
| Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
| Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
| Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
| Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
| CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
| Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
| Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
| Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
| Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
| Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
| Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
| Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
| Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
| pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
| Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
| Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
| Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are e.g. BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
| Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
| Water bath | Memmert | WNB 45 |
References
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