JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurosciences

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

Published: September 10, 2016
doi:
10.3791/54517
, ,
1Department of Chemosensation, Institute for Biology II,RWTH Aachen University, 2Mill Hill Laboratory,The Francis Crick Institute

Summary

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Abstract

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.

The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Introduction

Çoğu hayvan çevreleriyle etkileşim kimyasal duyu temeline dayanmaktadır. koku duyusu uygun çiftleşme ortakları bulma ve gıda değerlendirilmesi, yırtıcı kaçınarak ve bulmak için önemli bir rol oynar. Ana koku epiteli 1,2, Grueneberg ganglion 3,4, Masera 5,6 septal organ ve vomeronasal organı: En memelilerde, koku alma sistemi en az dört anatomik ve fonksiyonel olarak farklı çevresel alt sistemden oluşur. VNO kimlik, cinsiyet, sosyal rütbe ve cinsel devlet 7-10 hakkında bilgi veren kimyasal ipuçlarını tespit önemli bir rol oynar aksesuar koku alma sistemi (AOS), periferal duyusal yapıyı içermektedir. VNO sağ damak üzerinde burun septum dibinde yer almaktadır. Farelerde, bir kıkırdak kapsül 11-13 içine bir ikili kör bitmeyen bir borudur. Organ, bir hilal şeklinde medial duyusal epithe hem oluşurVSNs limanlar ve yan tarafında olmayan bir duyu kısmının Lium. Her iki epitel arasındaki dar vomeronasal kanalı 14 yoluyla burun boşluğuna bağlı olan bir mukus doldurulmuş lümen yer almaktadır. Olmayan duyu dokuda büyük bir yan damar negatif basınç 15,16 aracılığıyla bu VNO lümenine peptitler veya küçük proteinler gibi göreli olarak büyük, daha çok uçucu olmayan moleküllerin girişini kolaylaştırmak için, bir vasküler pompalama mekanizması sağlar. VNO yapısal bileşenler doğumda mevcut ve organ kısa bir süre ergenlik 17 önce yetişkin boyutuna ulaşır. Ancak, kemirgen AOS zaten gençler fonksiyonel olup olmadığını 18-20 tartışmaya hala tabidir.

VSNs kendi epitel konumu ve ifade reseptör tipine hem ile ayırt edilir. VSNs bir miyelinsiz akson ve lümen doğru çıkıntı ve bir microvillous dendritik topuzu ile biten bir tek apikal dendrit ile iki kutuplu bir morfoloji göstermektedir. VSN baltaons salkımlı, dorso-kaudal ucunda kıkırdaklı kapsül bırakır septum boyunca yükselir, aksesuar koku ampul (AOB) 21,22 ile kribriform plaka ve projeler geçer vomeronasal siniri oluşturur. vomeronasal duyusal epitel iki katmandan oluşur: apikal tabaka lümen yan ve limanlardan V1R- ve nöronlar FPR-R eksprese eden bir tür ise her iki yakın yer almaktadır. Bu nöronlar AOB 23-25 ​​ön kısmına G-proteini α alt birimi G αi2 projeyi birlikte ifade. G αo yanında daha bazal tabaka ekspres V2Rs veya FPR-Rs1 bulunan Duyu nöronları ve AOB 26-28 arka bölgeye kendi aksonları gönderin.

Vomeronasal nöronlar olasılıkla idrar, tükürük gibi çeşitli vücut sıvılarının salgılanan ve sıvı gözyaşı vardır oldukça küçük yarı-kimyasallara 29-33 (V1Rs) veya proteinli bileşiklerin 34-38 (V2Rs) tarafından aktive edilir 37,39-41 </sup>. Yerinde deneylerde VSNs da formilatlı peptidler ve çeşitli antimikrobik / enflamasyon bağlantılı bileşikler 25,42 ile aktive olduğunu göstermiştir. Ayrıca, heterolog FPR-rs proteinler (bkz 43 referans) conspecifics veya bozulmuş gıda kaynaklarından 25 hastalık için detektörleri gibi bir potansiyel rolü gösteren, bağışıklık sisteminde ifade FPRs ile agonist spektrumları paylaşmak dile getirdi.

Belirli VSN toplumlarda reseptör-ligand ilişkileri ve aşağı doğru sinyal kaskadlar anlamak için temel bir yerli bir ortamda temel biyofizik özellikleri ayrıntılı bir değerlendirmedir. Geçmişte, hücresel sinyal analizi, büyük ölçüde floresan işaretleyici protein 30,44-49 coexpressing tarafından nöronların tanımlanmış bir nüfusa işaret genetiği değiştirilmiş hayvanlardan faydalandı. Bu protokol, bir fluoresan işaretleyici ile birlikte FPR-RS3 eksprese eden bir transgenik fare hattı (FPR-RS3-i Venüs) kullanılır.Bu yaklaşım, akut koronal VNO doku dilimler halinde tek nöron patch-kelepçe kayıtları kullanarak optik tanımlanabilir hücre popülasyonunun elektrofizyolojik analizi gerçekleştirmek için böyle bir genetiği değiştirilmiş fare zorlanma istihdam nasıl örnekliyor. Bir hava basınç tahrikli çoklu varil perfüzyon sistemi duyusal uyaranlar ve farmakolojik ajanların kayıtları sırasında, hızlı tersinir ve fokal nöronal stimülasyon ya da önlenmesini sağlar. slice preparatlarda Tüm hücre kayıtları hücrenin doğal ortamında bir içsel özellikler, gerilim-etkin iletkenlikleri ayrıntılı analizi, hem de hareket potansiyeli boşaltım kalıpları için izin verir.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri deneysel amaçlar için kullanılan hayvanların korunması (Direktif 86/609 / EEC) ve önerileri Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu (FELASA) tarafından ileri sürülen yerel ve Avrupa Birliği mevzuatı ile uyum içinde idi. C57BL / 6 fareleri ve Fpr-RS3-i Venus farenin Hem yiyecek ve su ad libitum ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde, oda sıcaklığında, her iki cinsiyet grupları barındırıldı. deneyler için cinsiyet ya genç yetişkinler (6-20 ha…

Representative Results

Tanımlanmış hücre popülasyonlarının biyofiziksel ve fizyolojik özelliklerine anlamak için, biz fare VNO (- 2 Şekil 1) akut koronal doku dilimleri gerçekleştirin. Diseksiyon sonra, dilimler bir kaç saat süre ile buz soğukluğunda oksijenli hücre dışı çözelti (S2) 'de muhafaza edilebilir. Kayıt kurulumda, taze oksijenli çözümü ile bir sabit döviz (Şekil 2B) deney boyunca doku canlılığını sağ…

Discussion

VNO Semiokimyasallar tespit eden bir kimyasal-duyusal bir yapıdır. Bugüne kadar, vomeronasal reseptörlerinin çoğunluğu sadece birkaç reseptör-ligand çifti tespit edilmiş olarak deorphanized gerekmektedir. Bunlar arasında, V1rb2 erkek idrar feromon 2-heptanon 30 spesifik olarak aktive edilmesi tanımlanmıştır, V2rp5 erkek belirli feromon ESP1 57 da SYFPEITHI V2r1b ve V2rf2 MHC peptid ile aktive edilecek şekilde aktif hale 48 ve SEIDLILGY 58, sırasıyla. resept?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Ivan Rodriguez and Benoit von der Weid for generating the FPR-rs3-i-venus mouse line, their constructive criticism and fruitful discussions. This work was funded by grants of the Volkswagen Foundation (I/83533), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) and by the Excellence Initiative of the German federal and state governments. MS is a Lichtenberg Professor of the Volkswagen Foundation.

Materials

Chemicals
Agarose (low-gelling temperature) PeqLab 35-2030
ATP (Mg-ATP) Sigma-Aldrich A9187
Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) Sigma-Aldrich B9879
Calcium chloride Sigma-Aldrich C1016
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Glucose Sigma-Aldrich G8270
GTP (Na-GTP) Sigma-Aldrich 51120
(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 03564
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydrogen carbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Surgical tools and consumables
Large petri dish, 90 mm VWR decapitation, dissection of VNO capsule
Small petri dish, 35 mm VWR lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose
Sharp large surgical scissor Fine Science Tools decapitation, removal of lower jaw
Strong bone scissors Fine Science Tools cutting incisors
Medium forceps, Dumont tweezers #2 Fine Science Tools removing skin and palate
Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades  Fine Science Tools cutting out VNO 
Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 Fine Science Tools dissecting VNO out of cartilaginous capsule
Small stainless steel spatula Fine Science Tools handling agarose block and tissue slices
Surgical scalpel cutting agarose block into pyramidal shape
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Amplifier HEKA Elektronik EPC-10
Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) Science Products
CCD-camera Leica Microsystems DFC360FX
Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 Leica Microsystems I3
Fluorescence lamp Leica Microsystems EL6000
Hot plate magnetic stirrer Snijders 34532
Microforge  Narishige MF-830
Micromanipulator Device  Luigs & Neumann SM-5
Micropipette puller, vertical two-step Narishige PC-10 
Microscope Leica Microsystems CSM DM 6000 SP5
Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) Quest Scientific
Objective  Leica Microsystems HCX APO L20x/1.00 W
Oscilloscope Tektronik TDS 1001B
Osmometer  Gonotec Osmomat 030
Perfusion system 8-in-1 AutoMate Scientific
pH Meter five easy Mettler Toledo
Pipette storage jar World Precision Instruments e212
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Razor blades Wilkinson Sword GmbH Wilkinson Sword Classic
Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are e.g. BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) custom-made
Stereo microscope Leica Microsystems S4E
Trigger interface  HEKA Elektronik TIB-14 S
Vibratome  Leica Microsystems VT 1000 S
Water bath  Memmert WNB 45
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  2. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
  3. Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
  4. Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
  5. Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
  6. Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
  7. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  8. Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
  9. Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
  10. Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From Pheromones to Behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
  11. Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
  12. Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286 (5440), 716-720 (1999).
  13. Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
  14. Liberles, S. D. Mammalian pheromones. Annu. Rev. Physiol. 76, 151-175 (2014).
  15. Meredith, M., O’Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
  16. Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
  17. Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
  18. Coppola, D. M., O’Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
  19. Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
  20. Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
  21. Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
  22. Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
  23. Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
  24. Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
  25. Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
  26. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  27. Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
  28. Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
  29. Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
  30. Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
  31. Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
  32. Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
  33. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  34. Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
  35. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  36. Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
  37. Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
  38. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  39. Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
  40. Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
  41. Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
  42. Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
  43. Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
  44. Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
  45. Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
  46. Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
  47. Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
  48. Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
  49. Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
  50. Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
  51. Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
  52. Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
  53. Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
  54. Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
  55. Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
  56. Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
  57. Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
  58. Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
  59. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).

Tags

Keyword Extraction: Physiological AnalysisCell PopulationsMouse Vomeronasal OrganChemosensationSensory NeuronsNasal CavityVomer BoneVNO CapsuleCartilaginous Capsules
check_url/fr/54517?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Ackels, T., Drose, D. R., Spehr, M. In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ. J. Vis. Exp. (115), e54517, doi:10.3791/54517 (2016).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image