Rilevamento del pH-dipendente attività di<em> Escherichia coli</em> Chaperone HdeB<em> In Vitro</em> e<em> In Vivo</em
Summary
Questo studio descrive le tecniche biofisiche, biochimiche e molecolari per caratterizzare l'attività chaperone di Escherichia coli HdeB in condizioni di pH acido. Questi metodi sono stati applicati con successo per altri accompagnatori acido-protettivi come HdeA e può essere modificato a lavorare per altri accompagnatori e condizioni di stress.
Abstract
I batteri sono spesso esposti ai cambiamenti ambientali, come ad esempio le alterazioni di pH, la temperatura, lo stato redox, l'esposizione alla luce o forza meccanica. Molte di queste condizioni causare proteine dispiegarsi nella cella e avere un impatto negativo sulla sopravvivenza dell'organismo. Un gruppo di, chaperon molecolari indipendenti specifici di stress hanno dimostrato di svolgere un ruolo essenziale per la sopravvivenza di queste condizioni di stress. Mentre completamente piegata e chaperone-inattivo prima dello stress, queste proteine rapidamente svolgersi e diventare chaperone-attiva in condizioni di stress particolari. Una volta attivato, questi chaperon condizionatamente disordinati legano ad un gran numero di differenti proteine di aggregazione-inclini, prevenire la loro aggregazione e direttamente o indirettamente facilitare proteina ripiegamento su ritorno a condizioni di non-stress. L'approccio principale per ottenere una comprensione più dettagliata del meccanismo della loro attivazione e cliente riconoscimento comporta la purificazione e subsequent caratterizzazione di queste proteine mediante saggi in vitro chaperone. Follow-up de saggi di stress in vivo sono assolutamente essenziali per confermare in modo indipendente l'ottenuto dei risultati in vitro.
Questo protocollo descrive in vitro e in vivo metodi per caratterizzare l'attività chaperone di E. coli HdeB, un chaperone acido attivato. Misure di light scattering stati usati come una comoda lettura per la capacità di HdeB per prevenire l'aggregazione indotta da acido di un consolidato proteine client modello, MDH, in vitro. esperimenti ultracentrifugazione analitici sono stati applicati per rivelare la formazione di complesso tra HdeB e la sua LDH proteine cliente, di fare luce sulla sorte di proteine clienti al loro ritorno a condizioni di non-stress. saggi di attività enzimatica della proteine clienti sono stati condotti per monitorare gli effetti della HdeB sul pH indotta inattivazione del cliente e la riattivazione. Infine, studi di sopravvivenza sono stati usati per Monitor l'influenza della funzione di accompagnatore di HdeB in vivo.
Introduction
Un ambiente naturale comune in cui gli agenti patogeni microbici sperimentano proteine condizioni dispiegarsi acido-indotta è lo stomaco dei mammiferi (intervallo di pH 1-4), il cui pH acido serve come una barriera efficace contro gli agenti patogeni di origine alimentare 1. Proteine dispiegarsi e aggregazione, che è causato da protonazione catena laterale di aminoacidi, colpisce processi biologici, danni strutture cellulari e alla fine provoca la morte delle cellule 1,2. Poiché il pH del periplasma batterico equilibra quasi istantaneamente con il pH ambientale dovuto alla diffusione libera di protoni attraverso la membrana esterna porosa, proteine di membrana periplasmatiche ed interne di batteri Gram-negativi sono i componenti cellulari più vulnerabili in condizioni acido-stress 3. Per proteggere il loro proteoma periplasmic contro il Rapid danni da acido-mediata, batteri Gram-negativi utilizzano gli accompagnatori periplasmatiche acido attivato HdeA e HdeB. HdeA è un chaperone condizionalmente disordinati <sup> 4,5: A pH neutro, HdeA è presente come, dimero chaperone-inattiva piegato. C'era una variazione del pH pH inferiore a 3, la funzione di accompagnatore HdeA è rapidamente attivato 6,7. L'attivazione di HdeA richiede profondi cambiamenti strutturali, tra cui la sua dissociazione in monomeri, e parziale che si svolgevano dei monomeri 6-8. Una volta attivato, HdeA si lega alle proteine che si svolgono in condizioni acide. Si previene efficacemente la loro aggregazione sia durante l'incubazione a pH basso così come su pH di neutralizzazione. Al ritorno a pH 7,0, HdeA facilita il ripiegamento delle proteine cliente in forma di ATP-indipendenti e converte di nuovo nella sua dimerica, conformazione chaperone-inattiva 9. Allo stesso modo, il chaperone HdeB omologa è anche chaperone-inattivo a pH 7,0. A differenza HdeA, tuttavia, l'attività di accompagnatore HdeB raggiunge il suo massimo apparente a pH 4.0, condizioni in cui HdeB è ancora in gran parte piegata e dimerici 10. Inoltre, abbassando ulteriormente le Caus pHes l'inattivazione di HdeB. Questi risultati suggeriscono che, nonostante la loro ampia omologia, HdeA e HdeB differiscono nella loro modalità di attivazione funzionale che permette loro di coprire un ampio intervallo di pH con la loro funzione protettiva chaperone. Un altro accompagnatore che è stato implicato nella resistenza agli acidi di E. coli è il citoplasmatica Hsp31, che sembra stabilizzarsi proteine clienti ripiegate fino a condizioni neutre vengono ripristinati. La modalità d'azione preciso di Hsp31, tuttavia, è rimasto enigmatico 12. Dato che altri batteri enteropatogeni come Salmonella mancano dell'operone hdeAB, è molto probabile che potrebbero esistere altri accompagnatori periplasmatiche ancora non identificati che sono coinvolti nella resistenza agli acidi di questi batteri 11.
I protocolli qui presentati consentono di monitorare l'attività chaperone pH-dipendente di HdeB in vitro e in vivo 10 e possono essere applicati per investigare altri accompagnatoriquali Hsp31. In alternativa, la complessa rete di fattori di trascrizione che controllano l'espressione di hdeAB può potenzialmente essere studiata con il test di stress in vivo. Per caratterizzare la funzione delle proteine chaperone in vivo, diverse configurazioni sperimentali possono essere applicati. Una via è quella di applicare proteine dispiegarsi condizioni di stress e fenotipicamente caratterizzare ceppi mutanti che o iperesprimono il gene di interesse o portare una delezione del gene. Studi di proteomica possono essere condotti per identificare quali proteine non è più aggregato in condizioni di stress quando il chaperone è presente, o l'influenza di un accompagnatore su un enzima specifico può essere determinato in condizioni di stress utilizzando saggi enzimatici 14-16. In questo studio, abbiamo scelto di iperespressione HdeB in un ceppo rpoH cancellazione, a cui manca il fattore sigma shock termico 32. RpoH controlla l'espressione di tutti i principali E. accompagnatori coli e la sua eliminazione è noto per aumentare sensitivity a condizioni di stress ambientali che causano la proteina dispiegarsi 15. Il vivo l'attività di chaperone di HdeB è stata determinata monitorando la sua capacità di sopprimere la sensibilità pH del ceppo Δ rpoH. Complessivamente, i protocolli qui presentati forniscono un approccio veloce e semplice per caratterizzare l'attività di un chaperone acido attivato in vitro e nel contesto in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per studiare il meccanismo di attivazione e funzione chaperone di HdeB, grandi quantità di HdeB devono essere espresse e purificate. Un certo numero di sistemi di vettori di espressione sono disponibili per la produzione di alti livelli di una proteina bersaglio, comprese PTRC o pBAD vettori, entrambi i quali sono stati utilizzati in questo studio. I promotori sono facilmente accessibili per E. coli RNA polimerasi e l'espressione permettere così fortemente upregulated di HdeB in qualsiasi E. col…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Claudia Cremers per lei consigli utili su saggi chaperone. Ken Wan è riconosciuto per la sua assistenza tecnica nella purificazione HdeB. Questo lavoro è stato sostenuto dal Howard Hughes Medical Institute (a JCAB) e il National Institutes of Health sovvenzione RO1 GM102829 a JCAB e Ujj-UD è supportato da una borsa di ricerca post-dottorato fornita dalla German Research Foundation (DFG).
Materials
| NEB10-beta E. coli cells | New England Biolabs | C3019I | |
| Ampicillin | Gold Biotechnology | A-301-3 | |
| LB Broth mix, Lennox | LAB Express | 3003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C50 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Tris | Amresco | 0826-5kg | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Polymyxin B sulfate | ICN Biomedicals Inc. | 100565 | |
| 0.2 UM pore sterile Syringe Filter | Corning | 431218 | |
| HiTrap Q HP (CV 5 ml) | GE Healthcare Life Sciences | 17-1153-01 | |
| Mini-Protean TGX, 15% | Bio-Rad | 4561046 | |
| Malate dehydrogenase (MDH) | Roche | 10127914001 | |
| Potassium phosphate (Monobasic) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Potassium phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| F-4500 fluorescence spectrophotometer | Hitachi | FL25 | |
| Oxaloacetate | Sigma | O4126-5G | |
| NADH | Sigma | N8129-100MG | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9390-2.5KG | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S397-500 | |
| Lactate dehydrogenase (LDH) | Roche | 10127230001 | |
| Beckman Proteome Lab XL-I analytical Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392764 | https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render&wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/ |
| Centerpiece, 12 mm, Epon Charcoal-filled | Beckman Coulter | 306493 | |
| AN-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| Wizard Plus Miniprep Kit | Promega | A1470 | used for plasmid purification (Protocol 5.1) |
| L-arabinose | Gold Biotechnology | A-300-500 | |
| Glycine | DOT Scientific Inc | DSG36050-1000 | |
| Fluorescence Cell cuvette | Hellma Analytics | 119004F-10-40 | |
| Oligonucleotides | Invitrogen | ||
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| dNTP set | Invitrogen | 10297018 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Amicon Ultra 15 mL 3K NMWL | Millipore | UFC900324 | |
| Centrifuge Avanti J-26XPI | Beckman Coulter | 393127 | |
| Varian Cary 50 spectrophotometer | Agilent Tech | ||
| Spectra/Por 1 Dialysis Membrane MWCO: 6 kDa | Spectrum Laboratories | 132650 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 30K | Millipore | UFC803024 | |
| SDS | Fisher Scientific | bp166-500 | |
| Veriti 96-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher | 4375786 |
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