قابلية التصوير خلية على السقالات غير شفافة - استخدام مثال على رواية محبوك التيتانيوم زراعة الاسنان
Summary
هنا نقدم fluorophore أساس تقنية التصوير للكشف عن بقاء الخلية على السقالة التيتانيوم غير شفافة وكذلك للكشف عن لمحات من الشوائب سقالة. هذا البروتوكول يحل المشكلة والعيب من التصوير خلية خلية أو خلايا المعادن التفاعلات على السقالات غير شفافة.
Abstract
Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.
Introduction
آلام الظهر المزمنة هو مرض متعدد العوامل. زاد الاهتمام في خيار العلاج مينيملي لالأمراض التنكسية القرص منذ 1950s. حتى اليوم، متعدد قطعي التحام العمود الفقري هو العلاج الأكثر استخداما على نطاق واسع. منذ ذلك الحين، هذه الطريقة غالبا ما يؤدي إلى قيود في التنقل من شريحة المتضررين 1،2، أصبح التنقيب عن عصر تقويم مفاصل اهتمام واسع. أصبحت أوجه التقدم الكبير في مجموع استبدال القرص ونواة استبدال بديل جيد لعلاج آلام الظهر المزمنة 1. وعلى الرغم من التقدم الهائل، فإن أيا من الوسائل التي يتم تقييمها سريريا. تمثل عملية زرع نواة أقل صرامة بديلا واعدا لمجموع استبدال القرص، شريطة أن الحلقة الليفية سليمة 3،4. ومع ذلك، غالبا ما ترتبط يزرع نواة الموجودة حاليا في السوق مع مضاعفات مثل تغيرات في الجسم الفقري، والتفكك، وفقدان الارتفاع العمودي للقرص ورانه عدم وجود الضرورية المرتبطة صلابة الميكانيكية 5. من أجل التغلب على العوائق الحالية، زرع نواة رواية مصنوعة من الأسلاك التيتانيوم محبوك وقد وضعت بنجاح 6. نظرا لهيكل محبوك فريدة من نوعها، وقد أظهرت هذه السقالة وضعت حديثا الخصائص المتميزة النشاط الحيوي، على سبيل المثال، ميزة التخميد، حجم المسام، والقدرة على تحميل والموثوقية 7. تهدف لاختبار توافق مع الحياة من هذا زرع نواة الرواية، ويصور قيودا شديدة في (البصرية) تقنيات التحليل ينسب إلى الطبيعة غير الشفافة من عملية الزرع.
من أجل اختبار توافق مع الحياة والتفاعل خلية المعادن يلعب دورا بارزا 8-10. التفاعل بين الخلايا والسقالة ضروري لتحقيق الاستقرار، وبالتالي لدمج زرع أفضل داخل النظام المضيف. ومع ذلك، زيادة عمق نشوب قد يغير الخواص الميكانيكية للسقالة. تهدف إلى التحرياتtigate ما إذا كان سطح سقالة يوفر قاعدة لمرفق الخلية، وانتشار والتمايز أو ما إذا كان المعدن يؤثر بقاء الخلية، فمن المهم لاستكشاف المشكلة المشتركة المعروفة من تصوير الخلايا على / في السقالات غير شفافة وغير شفافة. ومن أجل التغلب على هذا القيد العديد من الفلورسنت واستكشاف التقنيات التي تعتمد. وتوفر شركات مجموعة كبيرة من fluorophores لتصور الخلايا الحية، المقصورات الخلوية، أو حتى الدول الخلوية محددة 11. وقد تم اختيار Fluorophores لهذه التجربة مع مساعدة من أداة المشاهد الطيفي عبر الإنترنت وذلك لتناسب قصارى جهدنا المجهر الفلورسنت.
الاستراتيجية التي وضعت لتحليل سلوك خلايا ملتصقة على / في غير شفافة سقالة التيتانيوم محبوك تشمل ما يلي: 1) فلوري (الأخضر بروتين فلوري / GFP) وسم الخلايا osteochondro-السلف للسماح تتبع الخلايا على سقالة، 2) قياس جدوى (ميتوالنشاط chondrial) من الخلايا، و 3) تصور خلية خلية والتفاعلات خلية المادية داخل سقالة. الإجراء لديه ميزة أنه يمكن نقلها بسهولة إلى الخلايا الملتصقة الأخرى وغيرها من غير شفافة أو غير شفافة سقالة. وعلاوة على ذلك، يمكن رصد سلامة ونمط نشوب على مدى عدة أيام، وبالتالي فإنه يمكن استخدامها مع كميات محدودة من المواد سقالة أو الخلايا.
توضح هذه الدراسة أن الاستخدام الناجح للبروتوكول الحالي لدينا لقياس بقاء الخلية وتصور نمط في نمو الخلايا osteochondro-السلف على / في غير شفافة سقالة التيتانيوم محبوك. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم البروتوكولات وضعت من أجل تحديد الشوائب سقالة وللتحقق بروتوكولات التنظيف.
Protocol
Representative Results
Discussion
سطح سقالة يلعب دورا هاما في تفاعلها مع الأنسجة المحيطة في الجسم الحي وبالتالي تحديد يزرع المتانة وظيفية. وهكذا، فإن دراسة التوافق الحيوي للسقالة من فحوصات في المختبر باستخدام خلايا (SCP1 خط الخلية)، عندما مطلي على السقالات.
<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:r…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويتم تمويل المشروع جزئيا ZENTRALES Innovationsprogramm Mittelstand (زيم) قصر Bundesministeriums FÜR فيرتشافت اوند اينرجي -KF3010902AJ4. وقد تم تغطية رسوم نشر من قبل الصدمة مستشفى BG توبنغن بألمانيا.
Materials
| 6/24/48 well plates, T25/ T75 culture flask | Greiner Bio-One GmbH | * |
| * 24 well plates | Greiner Bio-One GmbH | CELLSTAR 662 160 |
| * 48 well plates | Corning Incorporated USA | 3548 |
| * 6 well plates | Falcon | 353046 |
| * T25 | Greiner Bio-One GmbH | 690 175 |
| * T75 | Greiner Bio-One GmbH | 658 175 |
| Acetic acid, purum ≥ 99,0 % | Carl Roth | 3738.4 |
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 |
| Axioplan-2 | Carl Zeiss, Germany | |
| Biological safety cabinets | Thermo Scientific | safe 2020 |
| Calcein acetoxymethyl ester (calcein AM) | Sigma | 17783 |
| Cell Culture Incubtator | Binder, Tuttlingen, Germany | 9040-0078 |
| Filter unit (0.22µm) | Millipore, IRL | SLGP033RS |
| Centrifuges 5810 R And 5417 R | Thermo Fisher Scientific, NY | Megafuge 40R |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Carl Roth | 4720.2 |
| Dulbecco’s PBS without Ca & Mg | Sigma | H15-002 |
| Ethanol 99 % | SAV liquid prod. GmBH | 475956 |
| Ethidium homodimer | Sigma | 46043 |
| EVOS Fluorescence imaging system | Life technologies | AMF4300 |
| Fetal Bovine Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, PA, USA | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533-100MG |
| Knitted titanium nucleus implant | Buck co & KG,Germany | |
| MEM Alpha Modification with Glutamine w/o nucleoside | Sigma | E15-832 |
| Omega microplate Reader | BMG Labtech,Germany | FLUOstar Omega |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P11-010 |
| Resazurin sodium salt | Sigma | 199303-1G |
| Sulforhodamine B sodium salt | Sigma | S1402-1G |
| Test tube rotator | Labinco B.V.,The Netherlands | Model LD-76 |
| TRIS (hydroxymethyl) aminomethan | Carl Roth | AE15.1 |
| Triton | Carl Roth | 3051.2 |
| Trypan Blue 0.5 % | Carl Roth | CN76.1 |
| Trypsin/EDTA | Sigma | L11-004 |
References
- Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. What’s new in spine surgery. J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).
- Adams, M. A., Dolan, P. Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes. J Anat. 221, 497-506 (2012).
- Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. Disc degeneration: current surgical options. Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).
- Lewis, G. Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).
- Cunningham, B. W. Basic scientific considerations in total disc arthroplasty. Spine J. 4, 219-230 (2004).
- Buck, A. E., Kaps, H. -. P. Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. , (2014).
- Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments. SAS J. 1, 125-130 (2007).
- Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering. J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).
- Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. Biomedical applications of titanium and its alloys. JOM. 60, 46-49 (2008).
- Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. Biomaterial optimization in total disc arthroplasty. Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).
- Gustafsdottir, S. M. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 8, e80999 (2013).
- Bocker, W., et al. Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer. J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).
- Ehnert, S., et al. Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy. BMC Med. 10, 101 (2012).
- Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. . Optical Techniques in Regenerative Medicine. , (2013).
- Vielreicher, M., et al. Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine. J R Soc Interface. 10, 20130263 (2013).
- Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).
- Niu, G., et al. Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).
- Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration. Osteoarthritis Cartilage. , (2015).
- . Thermofisher Fluorescence Spectraviewer Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html (2016)
