Automatiserad Acoustic Utlämning för serieutspädning av peptidagonister i Styrka Fastställande Analyser

Summary

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Abstract

Som med liten molekyl läkemedelsutveckling, screening för peptidagonister kräver serieutspädning av peptider för att producera koncentration-responskurvor. Screening peptider ger ett extra lager av komplexitet som konventionella provhanteringsmetoder spetsbaserade utsätta peptider till en stor yta av plasten, vilket ger en ökad möjlighet för peptidförlust via adsorption. Förhindra överdriven exponering för plasten minskar peptidförlust via anslutning till plast och därmed minimerar felaktigheter i styrka förutsägelse, och vi har tidigare beskrivit fördelarna med beröringsfri akustisk utmatning för in vitro-high-throughput screening av peptid agonister ^1. Här diskuterar vi en helt integrerad automatisering lösning för beröringsfri akustiska beredning av peptid serieutspädningar i mikrotiterplattor med användning av exemplet med screening för peptidagonister vid mus glukagonliknande peptid-1-receptor (GLP-1 R). Våra metoder gör det möjligt för hög-throughput cellbaserade analyser för att screena för agonister och är skalbar för att stödja ökad provkapacitet, eller för att möjliggöra ett ökat antal analysplattkopior (t.ex. för en panel av flera mål cellinjer).

Introduction

GLP-1R är en etablerad läkemedelsmål för behandling av typ 2-diabetes ^2. Den nativa peptiden agonist för denna receptor, GLP-1, har en in vivo-halveringstid på 2-3 min ^tre. Bindningen av GLP-1 till dess G-proteinkopplade mål-receptor resulterar i nedströms produktionen av den andra budbäraren cAMP genom nativt G proteinkoppling till aktivering av adenylylcyklas. Mätning av den ackumulerade cAMP ger en robust analys för att övervaka receptoraktivering och för att screena för aktiva GLP-1-analoger med önskad fysikalisk-kemiska egenskaper. en sådan analys kräver serieutspädning av testprover för att konstruera koncentration-responskurvor, och detta är särskilt komplicerat när handing peptidprover. Potentiella fel från spets baserade serieutspädnings beredning har beskrivits tidigare ^1,4,5. Peptider bindas till plasten, vilket resulterar i otillförlitliga uppskattningar potens. Peptid förlust kan minimeras genom than inkludering av bovint serumalbumin (BSA) i buffertar och användningen av silikoniserade plasticware, men ändå protein bindning förblir oförutsägbar. I synnerhet, har den variation i bindning av GLP-1 till försöksbehållare beskrivits ^sex. Det finns en ytterligare komplikation i att stabiliseringsmedel som används i laboratorieplastartiklar kan läcka från tips och mikrotiterplattor i vattenanalysbuffertar och störa proteiners funktion ^{7, 8.} Därför metoder för att minska exponeringen för plasten är nödvändiga för att öka noggrannheten i mätningarna.

Akustiska vätskemätare fokusera en högfrekvent akustisk signal på ytan av ett vätskeprov, vilket resulterar i utstötning av exakta nanoliterdroppar in i ett angränsande analysplatta ^9. Användningen av akustiska utstötning är standard inom läkemedelsindustrin för framställning och screening av stora syntetiska substansbibliotek, och tekniken har väl validerade för små molecules ^10. Så vitt vi vet är vi den första gruppen för att beskriva akustisk utmatning för framställning av rekombinanta och syntetiska peptider och vi har tidigare rapporterat förbättrad noggrannhet jämfört med konventionella spetsbaserade metoder ^1.

I den här artikeln beskriver integrationen av beredningen av peptidserie och direkta späd av beröringsfri akustisk överföring till en helt automatiserad plåthantering robotsystem. Ett antal metoder som omfattar akustisk överföring av prover har beskrivits tidigare ^11. Vi använder en två-stegsmetod för framställning av mellanliggande förrådskoncentrationer och för att seriellt späda peptidanaloger för generering av den fullständiga dos-responskurva. De framställda peptider inkuberas med celler som uttrycker målet mus GLP-1R, och vi använder en kommersiellt tillgänglig homogen tidsupplöst fluorescens (HTRF) analys för att mäta cAMP-ackumulering i dessa celler som en avläsning av peptidagonist activheten. Analysen är robust och mottaglig för en hög genomströmning 384 brunnar och rutinmässigt appliceras på både metodutveckling och läkemedelsscreening projekt ^12.

Protocol

1. Peptid serieutspädning Förbereda analysbuffert: Hanks buffrade saltlösning (HBSS) med tillsats av 25 mM HEPES, 0,1% BSA och 0,5 mM 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX), pH 7,4. Använda en bulkreagensfördelaren att systematiskt lägga 5 | il av analysbuffert till varje brunn i fem 384-brunnars låga volym analysplattor. Använd intern programvara för att skapa en dispenseringsprogram för 5 l volym utöver varje brunn i en 384-brunnar enligt tillverkarens anvisningar. Sänk dis…

Representative Results

Vi använder rutinmässigt en två-stegsmetod för att späda peptider via akustisk överföring. För det första steget, är en akustisk dispenser inriktad med automatisering som används för att skapa fyra lager peptidmellan utspädningar tvärsöver två källplattor (Figur 1a, b). För det andra steget använder vi en akustisk dispenser för att ytterligare späda aktie utspädningar från källplattor A och B för att skapa en 11-punkters ko…

Discussion

Detta protokoll beskriver en framgångsrik tillämpning av automatiserad akustisk serveringen seriellt späda peptidprov över ett koncentrationsintervall av 3 x 10 ⁶ kräver mindre än 1 pl prov. Den stora fördelen med denna metod är att öka datakvaliteten genom minimering peptid adsorption till plasten genom reducerad exponering av prover till experimentella behållare och plasticware (såsom pipettspetsar) som normalt krävs för reagensöverföring och blandning. Även akustisk utmatning inte helt utes…

Materials

Hanks’ Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide	Bachem	H-6795	Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control'
Test peptides	Produced in-house at MedImmune		Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100X peptide stock	Produced in-house at MedImmune		Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Cedex XS Cell Analyzer	Innovatis
Corning 384 well plates, low volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate	Labcyte Inc.	P-05525
Echo Qualified Reservoir	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer