Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.
Som med liten molekyl läkemedelsutveckling, screening för peptidagonister kräver serieutspädning av peptider för att producera koncentration-responskurvor. Screening peptider ger ett extra lager av komplexitet som konventionella provhanteringsmetoder spetsbaserade utsätta peptider till en stor yta av plasten, vilket ger en ökad möjlighet för peptidförlust via adsorption. Förhindra överdriven exponering för plasten minskar peptidförlust via anslutning till plast och därmed minimerar felaktigheter i styrka förutsägelse, och vi har tidigare beskrivit fördelarna med beröringsfri akustisk utmatning för in vitro-high-throughput screening av peptid agonister 1. Här diskuterar vi en helt integrerad automatisering lösning för beröringsfri akustiska beredning av peptid serieutspädningar i mikrotiterplattor med användning av exemplet med screening för peptidagonister vid mus glukagonliknande peptid-1-receptor (GLP-1 R). Våra metoder gör det möjligt för hög-throughput cellbaserade analyser för att screena för agonister och är skalbar för att stödja ökad provkapacitet, eller för att möjliggöra ett ökat antal analysplattkopior (t.ex. för en panel av flera mål cellinjer).
GLP-1R är en etablerad läkemedelsmål för behandling av typ 2-diabetes 2. Den nativa peptiden agonist för denna receptor, GLP-1, har en in vivo-halveringstid på 2-3 min tre. Bindningen av GLP-1 till dess G-proteinkopplade mål-receptor resulterar i nedströms produktionen av den andra budbäraren cAMP genom nativt G proteinkoppling till aktivering av adenylylcyklas. Mätning av den ackumulerade cAMP ger en robust analys för att övervaka receptoraktivering och för att screena för aktiva GLP-1-analoger med önskad fysikalisk-kemiska egenskaper. en sådan analys kräver serieutspädning av testprover för att konstruera koncentration-responskurvor, och detta är särskilt komplicerat när handing peptidprover. Potentiella fel från spets baserade serieutspädnings beredning har beskrivits tidigare 1,4,5. Peptider bindas till plasten, vilket resulterar i otillförlitliga uppskattningar potens. Peptid förlust kan minimeras genom than inkludering av bovint serumalbumin (BSA) i buffertar och användningen av silikoniserade plasticware, men ändå protein bindning förblir oförutsägbar. I synnerhet, har den variation i bindning av GLP-1 till försöksbehållare beskrivits sex. Det finns en ytterligare komplikation i att stabiliseringsmedel som används i laboratorieplastartiklar kan läcka från tips och mikrotiterplattor i vattenanalysbuffertar och störa proteiners funktion 7, 8. Därför metoder för att minska exponeringen för plasten är nödvändiga för att öka noggrannheten i mätningarna.
Akustiska vätskemätare fokusera en högfrekvent akustisk signal på ytan av ett vätskeprov, vilket resulterar i utstötning av exakta nanoliterdroppar in i ett angränsande analysplatta 9. Användningen av akustiska utstötning är standard inom läkemedelsindustrin för framställning och screening av stora syntetiska substansbibliotek, och tekniken har väl validerade för små molecules 10. Så vitt vi vet är vi den första gruppen för att beskriva akustisk utmatning för framställning av rekombinanta och syntetiska peptider och vi har tidigare rapporterat förbättrad noggrannhet jämfört med konventionella spetsbaserade metoder 1.
I den här artikeln beskriver integrationen av beredningen av peptidserie och direkta späd av beröringsfri akustisk överföring till en helt automatiserad plåthantering robotsystem. Ett antal metoder som omfattar akustisk överföring av prover har beskrivits tidigare 11. Vi använder en två-stegsmetod för framställning av mellanliggande förrådskoncentrationer och för att seriellt späda peptidanaloger för generering av den fullständiga dos-responskurva. De framställda peptider inkuberas med celler som uttrycker målet mus GLP-1R, och vi använder en kommersiellt tillgänglig homogen tidsupplöst fluorescens (HTRF) analys för att mäta cAMP-ackumulering i dessa celler som en avläsning av peptidagonist activheten. Analysen är robust och mottaglig för en hög genomströmning 384 brunnar och rutinmässigt appliceras på både metodutveckling och läkemedelsscreening projekt 12.
Detta protokoll beskriver en framgångsrik tillämpning av automatiserad akustisk serveringen seriellt späda peptidprov över ett koncentrationsintervall av 3 x 10 6 kräver mindre än 1 pl prov. Den stora fördelen med denna metod är att öka datakvaliteten genom minimering peptid adsorption till plasten genom reducerad exponering av prover till experimentella behållare och plasticware (såsom pipettspetsar) som normalt krävs för reagensöverföring och blandning. Även akustisk utmatning inte helt utes…
The authors have nothing to disclose.
None.
Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control' |
Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
100X peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |