तरीके लसीका ग्रंथि और hemocytes में जांच<em> ड्रोसोफिला</em> लार्वा
Summary
ड्रोसोफिला और स्तनधारी hematopoietic सिस्टम कई आम सुविधाओं का हिस्सा है, hematopoiesis अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक ड्रोसोफिला आनुवंशिक मॉडल बना रही है। यहाँ हम विच्छेदन और immunohistochemistry के लिए प्रमुख लार्वा hematopoietic अंग के बढ़ते प्रदर्शित करता है। हम यह भी घूम hemocytes और बिना डंठल क्रिस्टल कोशिकाओं सहित विभिन्न लार्वा hematopoietic डिब्बों की परख के लिए विधियों का वर्णन।
Abstract
कई समानताएं ड्रोसोफिला और स्तनधारी hematopoietic प्रणालियों के बीच मौजूद हैं, भले ही ड्रोसोफिला लसीकावत् वंश कि स्तनधारी प्रतिरक्षा अनुकूली को चिह्नित की कमी है। ड्रोसोफिला और स्तनधारी hematopoiesis spatially और अस्थायी अलग चरणों में होते हैं कई रक्त सेल प्रजातियों के उत्पादन के लिए। दोनों प्रणालियों रक्त कोशिका पूर्वज जो साथ विस्तार या परिपक्व प्रजातियों को बदलने के लिए के जलाशयों बनाए रखें। Hematopoietic प्रणाली ड्रोसोफिला और स्तनधारियों के लिए प्रतिक्रिया करने और प्रतिरक्षा चुनौतियों के लिए अनुकूल करने के लिए अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात है, transcriptional नियामकों और संकेत मार्ग है कि उत्पादन, रखरखाव, और hematopoietic प्रणाली के समारोह को नियंत्रित स्तनधारियों के लिए मक्खियों से संरक्षित कर रहे हैं। इन समानताओं ड्रोसोफिला आनुवंशिक रूप से मॉडल hematopoietic विकास और रोग के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं।
यहाँ हम विस्तार assays ड्रोसोफिला लार्वा की hematopoietic प्रणाली की जांच करने के लिए। मेंविशेष रूप से, हम, रक्त कोशिका की संख्या और एकाग्रता को मापने विवो में एक विशिष्ट परिपक्व वंश कल्पना है, और संचलन में और hematopoietic अंग में रक्त कोशिकाओं पर immunohistochemistry प्रदर्शन करने के तरीकों की रूपरेखा तैयार। ये assays जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन और संकेतन, अस्तित्व, प्रसार, और भेदभाव सहित सेलुलर प्रक्रियाओं प्रकट कर सकते हैं और hematopoiesis संबंधित प्रश्नों की एक किस्म की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ड्रोसोफिला में उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त, इन assays परिभाषित आनुवंशिक परिवर्तन पर hematopoietic प्रणाली का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जबकि विशेष रूप से यहां नहीं उल्लिखित, इन assays भी इस तरह के संक्रमण या आहार के रूप में पर्यावरण परिवर्तन, के प्रभाव, hematopoietic प्रणाली पर जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
जटिल प्रतिलेखन कारक और संकेत रास्ते कि hematological रोगों में hematopoietic प्रणाली के विकास और कहा कि खराबी के समन्वय के विनियमन तंत्र खराब समझ रहते हैं। ये प्रतिलेखन कारक है और संकेत दे रास्ते के साथ-साथ उनके विनियमन, अत्यधिक ड्रोसोफिला और स्तनधारी hematopoiesis 1-5 के बीच संरक्षित कर रहे हैं। इस प्रकार ड्रोसोफिला hematopoietic प्रणाली hematopoiesis और अंतर्निहित hematological रोगों को नियंत्रित करने के आणविक तंत्र को परिभाषित करने के लिए एक उत्कृष्ट आनुवंशिक मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है।
स्तनधारियों के लिए इसी प्रकार, ड्रोसोफिला hematopoiesis की spatially और अस्थायी अलग चरणों में रक्त कोशिकाओं, hemocytes कहा जाता है, उत्पन्न करते हैं। परंपरागत रूप से, ड्रोसोफिला hematopoiesis भ्रूण mesoderm में और लार्वा लसीका ग्रंथि में चरणों के लिए प्रतिबंधित किया गया था। कि hematopoiesis भी लार्वा बिना डंठल CLU में होता है हाल के अध्ययनों से सबूत उपलब्ध करानेsters और 6-8 पेट वयस्क में। plasmatocytes और क्रिस्टल कोशिकाओं: सभी hematopoietic चरणों परिपक्व hemocytes के दो प्रकार का उत्पादन। Plasmatocytes phagocytosis, सहज प्रतिरक्षा, और घाव भरने में शामिल मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह कर रहे हैं। क्रिस्टल कोशिकाओं समर्थक phenoloxidases melanization, कीट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और घाव भरने में इस्तेमाल के लिए एक प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक होते हैं। लार्वा hematopoiesis एक तिहाई परिपक्व hemocyte प्रकार उत्पन्न कर सकते हैं, एक lamellocyte बुलाया ऐसे परजीवी ततैया संक्रमण 9,10 के रूप में कुछ प्रतिरक्षा चुनौतियों के जवाब में। Lamellocytes बड़े, पक्षपाती कोशिकाओं कि समारोह, plasmatocytes और क्रिस्टल कोशिकाओं के साथ संयोजन के रूप में, encapsulate और ड्रोसोफिला लार्वा में रखी ततैया अंडे को बेअसर करने के लिए कर रहे हैं। parasitization के अभाव में, lamellocytes जंगली प्रकार लार्वा में नहीं पाए जाते हैं। Melanotic जनता melanized, समझाया ततैया अंडे जैसे लगते हैं; कई उत्परिवर्ती ड्रोसोफिला उपभेदों parasitization के अभाव में melanotic जनता का विकास। lamello की उपस्थितिcytes और / या melanotic जनता hematopoietic असामान्यताओं का संकेत हो सकता है। वास्तव में, बड़े पैमाने पर melanotic phenotype जीन और रास्ते hematopoiesis 11-14 में शामिल की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
लार्वा hematopoietic प्रणाली सबसे बड़े पैमाने पर तारीख करने के लिए अध्ययन किया है। यह hemolymph में घूम hemocytes के शामिल है, बिना डंठल hemocyte समूहों छल्ली तहत नमूनों, और hemocytes लसीका ग्रंथि में रहने वाले। लसीका ग्रंथि द्विपक्षीय पृष्ठीय पोत से जुड़ी पालियों की एक श्रृंखला है। लसीका ग्रंथि के प्रत्येक प्राथमिक पालि तीन मुख्य क्षेत्रों में विभाजित है। सबसे बाहरी क्षेत्र cortical क्षेत्र के रूप में जाना जाता है और hemocytes परिपक्व होता है। अंतरतम क्षेत्र दिमाग़ी क्षेत्र कहा जाता है और मौन hemocyte व्यापारियों के शामिल है। तीसरे जोन, पीछे संकेत केंद्र, लसीका ग्रंथि है कि एक स्टेम सेल की तरह आला के रूप में कार्य के आधार पर कोशिकाओं का एक छोटा सा समूह है। प्रारंभिक कार्य पायदान 15-18 के लिए महत्वपूर्ण कार्यों की स्थापना </sup>, हाथी 19,20, जे ए-स्टेट 18, और 21 Wingless गतिविधि लार्वा लसीका ग्रंथि विकास को विनियमित करने के लिए। हाल के अध्ययनों ने दिखा दिया है कि बीएमपी 22, FGF-रास 23, और हिप्पो 24,25 सिगनल भी लार्वा लसीका ग्रंथि के भीतर कार्य करते हैं।
चार लार्वा hematopoietic यहाँ रेखांकित assays 1) घूम hemocyte एकाग्रता, प्रति इकाई मात्रा कोशिकाओं की संख्या के रूप में परिभाषित मापने, 2) को अलग-थलग और फिक्सिंग immunohistochemistry के लिए घूम hemocytes, 3) विवो में क्रिस्टल कोशिकाओं visualizing, और 4) विदारक, फिक्सिंग, और बढ़ते वर्णन लसीका ग्रंथियों immunohistochemistry के लिए। ये assays hematopoietic readouts कार्यों और लार्वा hematopoietic प्रणाली में रास्ते के संकेत के नियमों का आकलन करने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इन तरीकों के क्षेत्र में पहले से इस्तेमाल किया गया है, इन assays के दृश्य प्रलेखन हाल ही में 8,26-30 शुरू हो गया है। यहाँ उद्धृत कई प्रकाशनों मदद कर रहे हैंful संसाधनों इसी तरह के तरीकों और hematopoietic मार्कर 26,31-33 का वर्णन है। इसके अतिरिक्त, Trol और वाइकिंग लसीका ग्रंथि तहखाने झिल्ली के उपयोगी मार्करों हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
आनुवंशिक या पर्यावरण परिवर्तन करने पर, चार विधियों यहाँ वर्णित व्यक्तिगत रूप से या संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है इस तरह के संकेत दे, अस्तित्व, प्रसार, और भेदभाव के रूप में hematopoiesis दौरान विशिष्…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Matthew O’Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O’Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.
Materials
| PBS tablets | MP Biomedicals | 2810305 | |
| dissecting dish | Corning | 7220-85 | |
| microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit | Krayden (distributed through Fisher) | NC9644388 (Fisher catalog number) | Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions. |
| stereomicroscope | Morrell Instruments (Nikon distributor) | mna42000, mma36300 | Nikon models SMZ1000 and SMZ645 |
| tissue wipe | VWR | 82003-820 | |
| forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| p200 pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | |
| formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Triton | Fisher | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| bovine serum albumin | Rocky Mountain Biologicals | BSA-BSH-01K | |
| normal goat serum | Sigma | G9023-10ML | |
| normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| 200 proof ethanol | VWR | V1001 | |
| N-propyl gallate | MP Biomedicals | 102747 | |
| glycerol | VWR | EM-4750 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) | Fisher | 62248 | |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| microscope cover glass, 22 mm square | Fisher | 12-544-10 | |
| microscope cover glass, 18mm circular | Fisher | 12-545-100 | |
| glass microscope slides | Fisher | 22-034-980 | |
| thermal cycler | Eppendorf | E950010037 | Mastercycler EP Gradient S |
| PCR tubes | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 24-well plate | Corning | 351147 | |
| disposable transfer pipet | Fisher | 13-711-9AM | |
| fluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager.Z1 |
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