Metoder for å undersøke lymfekjertel og Hemocytes i<em> Drosophila</em> Larver

Summary

Drosophila og pattedyr blodkreft systemer har mange fellestrekk, noe som gjør Drosophila en attraktiv genetisk modell for å studere hematopoiesis. Her viser vi disseksjon og montering av de store larve blodkreft organ for immunhistokjemi. Vi beskriver også metoder for å analysere ulike larve blodkreft avdelinger inkludert sirkulasjons hemocytes og fastsittende krystall celler.

Abstract

Mange paralleller eksisterer mellom Drosophila og pattedyr blodkreft systemer, selv om Drosophila mangler lymfoidlinjen som kjennetegner pattedyr adaptiv immunitet. Drosophila og pattedyr hematopoiesis oppstå i romlig og tidsmessig forskjellige faser for å produsere flere blodceller linjene. Begge systemene opprettholde reservoarer av blodceller stamfedre med å utvide eller erstatte eldre linjene. Den blodkreft systemet tillater Drosophila og pattedyr for å svare på og å tilpasse seg immun utfordringer. Viktigere er de transkripsjons regulatorer og signalveier som styrer generasjon, vedlikehold og funksjon av hematopoetiske system bevart fra fluer til pattedyr. Disse likhetene tillate Drosophila som skal brukes for å genetisk modell hematopoietisk utvikling og sykdom.

Her har vi detaljanalyser for å undersøke hematopoetiske system av Drosophila larver. ISpesielt skissere vi metoder for å måle blodcelletall og konsentrasjon, visualisere en bestemt moden avstamning in vivo, og utføre immunhistokjemi på blodceller i omløp og i blodkreft organ. Disse analyser kan avdekke endringer i genekspresjon og cellulære prosesser, inkludert signalering, overlevelse, proliferasjon og differensiering, og kan brukes til å undersøke en rekke spørsmål om hematopoiesis. Kombinert med de genetiske verktøy tilgjengelig i Drosophila, kan disse analysene brukes til å evaluere den hematopoetiske system på definerte genetiske endringer. Selv om det ikke spesifikt er beskrevet her, kan disse analysene også bli brukt til å undersøke effekten av miljømessige forandringer, for eksempel infeksjon eller diett, på det hematopoetiske system.

Introduction

De komplekse mekanismer som regulerer transkripsjonsfaktorer og signalveier som koordinerer utviklingen av det hematopoetiske system og at feil i det hematologiske sykdommer forblir dårlig forstått. Disse transkripsjonsfaktorer og signalveier, samt deres regulering, er høyt konservert mellom Drosophila og pattedyr hematopoiesis ^1-5. Således Drosophila hematopoetiske system representerer en utmerket genetisk modell for å definere de molekylære mekanismene som kontrollerer hematopoese og underliggende hematologiske sykdommer.

I likhet med pattedyr, Drosophila generere blodceller, kalt hemocytes, i romlig og tidsmessig forskjellige faser av hematopoiesis. Tradisjonelt ble Drosophila hematopoiesen tenkt å være begrenset til fasene i embryonale mesoderm og i larve lymfekjertel. Nyere studier gir holdepunkter for at hematopoiesis også forekommer i larvefastsittende cluhyller og i voksen magen ^6-8. Alle blodkreft faser produserer to typer modne hemocytes: plasmatocytes og krystall celler. Plasmatocytes er makrofaglignende celler involvert i fagocytose, medfødt immunitet, og sårheling. Crystal celler inneholder pro-phenoloxidases kreves for melanization, en reaksjon som brukes i insektsimmunresponser og sårheling. Larve hematopoiese kan generere en tredje moden hemocyte type, kalt en lamellocyte, som reaksjon på visse immunutfordringer som parasittvepser infeksjon ^9,10. Lamellocytes er store, tilhenger celler som fungerer, i forbindelse med plasmatocytes og krystallceller, for å kapsle og nøytralisere vepse egg legges i Drosophila larver. I fravær av parasitization, blir lamellocytes ikke funnet i villtype-larver. Melanotiske massene ligne melanized, innkapslet vepse egg; mange mutant Drosophila stammer utvikle melanotiske massene i fravær av parasitization. Tilstedeværelsen av Lamellocytes og / eller melanotiske masser kan være en indikasjon på blodkreft unormalt. Faktisk har den melanotisk massen fenotype blitt brukt til å identifisere gener og veier som er involvert i hematopoiesis ^11-14.

Larve hematopoetiske system er den mest omfattende studert til dags dato. Den består av hemocytes sirkulerer i hemolymph, fastsittende hemocyte klynger mønstret under skjellaget, og hemocytes bosatt i lymfe kjertel. Den lymfekjertel er en serie av bilaterale fliker som er festet til ryggbeholderen. Hver primære flik av lymph kjertel er delt inn i tre hovedsoner. Den ytterste sone er kjent som kortikal sonen og inneholder modning hemocytes. Den innerste sone kalles medullær sonen og består av hvilende hemocyte forløpere. Den tredje sone, den bakre signaleringssenter, er en liten gruppe av celler i bunnen av den lymfekjertel som fungerer som en stamcelle-lignende nisje. Tidlig arbeid etablert kritiske funksjoner for Notch ^15-18 </sup>, Hedgehog ^19,20, JAK-STAT ^18, og Vingeløse ²¹ aktivitet for å regulere larve lymph kjertel utvikling. Nyere studier har vist at BMP ^22, FGF-Ras ^23, og Hippo ^24,25 signale også fungere innenfor larve lymph kjertel.

Fire larve hematopoetiske assays som er beskrevet her beskriver 1) måling av sirkulerende hemocyte konsentrasjon, som er definert som antall celler pr volumenhet, 2) isolering og feste sirkulerende hemocytes for immunhistokjemi, 3) visualisering krystall-celler in vivo, og 4) dissekere, festing, og monterings lymfekjertler for immunhistokjemi. Disse analysene kan brukes som blodkreft avlesninger for å vurdere funksjoner og reguleringer av signalveier i larve hematopoetiske system. Selv om disse metodene har blitt brukt tidligere i felten, har visuell dokumentasjon av disse analysene begynt nylig ^8,26-30. Flere publikasjoner sitert her er hjelpful ressurser som beskriver lignende metoder og blodkreft markører ^26,31-33. I tillegg Trol og Viking er nyttige markører for lymfe kjertel basalmembran.

Protocol

1. Sirkulasjons Hemocyte Konsentrasjon For å oppnå larver av omtrent samme utviklingsstadiet for denne analysen, begrense egg samling ved at hunner for å legge egg i en fast tidsperiode på 2 – 6 timer. Samle larver i dissekere oppvask brønnene fylt med 1 x fosfatbufret saltvann (PBS, tabell 1). For hver larve, legger 10 mL 1x PBS i en mikro rør på is og 10 mL 1x PBS på en ren dissekere pad. Plasser dissekere pad på en opplyst stereomikroskop base. Tørk …

Representative Results

Sirkulasjons Hemocyte Konsentrasjon Hemocyte tallene øker hele larveutvikling 35. For å illustrere at denne metoden detekterer forskjeller i hemocyte tall og konsentrasjon, uavhengig av biologisk årsak, målte vi hemocyte konsentrasjoner av forsinkede og ikke-forsinkede larver. Tap av prothorakikotropt hormon (PTTH) ved genetisk ablasjon av PTTH-produserende nevroner (PTTH> dystre) gir en forsinkelse i larveutvik…

Discussion

Ved genetisk eller miljømessig endring, kan de fire fremgangsmåter som er beskrevet her brukes enkeltvis eller i kombinasjon for å analysere forskjellige prosesser i løpet av hematopoiesis slik som signalering, overlevelse, proliferasjon, differensiering og Drosophila hematopoiesis er en dynamisk prosess.; antall hemocytes per dyr øker ³⁵ og strukturen og genekspresjon av lymfekjertel endres ³² under utvikling. Før du utfører disse analysene, derfor er det viktig å begrense egg sam…

Materials

PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
hemocytometer	Hausser Scientific	3200
trypan blue stain	Life Technologies	T10282
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
6-well plate	Corning	351146
12-well plate	Corning	351143
microscope cover glass, 22 mm square	Fisher	12-544-10
microscope cover glass, 18mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
thermal cycler	Eppendorf	E950010037	Mastercycler EP Gradient S
PCR tubes	USA Scientific	1402-2700
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1