केशिका वैद्युतकणसंचलन रीयल टाइम में chitosan फिल्में पर पेप्टाइड ग्राफ्टिंग नजर रखने के लिए
Summary
Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.
Abstract
नि: शुल्क समाधान केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) एक बिजली के क्षेत्र के आवेदन के माध्यम से समाधान में analytes, आम तौर पर आरोप लगाया यौगिकों को अलग करती है। ऐसे क्रोमैटोग्राफी के रूप में अन्य विश्लेषणात्मक जुदाई तकनीक, की तुलना में, सीई सस्ते, मजबूत है और प्रभावी ढंग से कोई नमूना तैयार (जटिल प्राकृतिक matrices या बहुलक नमूनों की एक संख्या के लिए) की आवश्यकता है। सीई तेज है और वास्तविक समय (जैसे, रासायनिक प्रतिक्रिया कैनेटीक्स) में मिश्रण के विकास का पालन करने के लिए, के रूप में संकेतों अलग यौगिकों के लिए मनाया सीधे समाधान में उनकी मात्रा के लिए आनुपातिक हैं इस्तेमाल किया जा सकता है।
इधर, सीई की दक्षता बाद में जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए chitosan फिल्मों पर पेप्टाइड्स के सहसंयोजक कलम बांधने का काम की निगरानी के लिए प्रदर्शन किया है। Chitosan के रोगाणुरोधी और biocompatible गुण यह इस तरह के सेल के विकास substrates के रूप में जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एक आकर्षक सामग्री बनाने। Covalently पेप्टाइड RGDS (arginine ग्राफ्टिंग – ग्लाइसिन -aspartic एसिड – सेरीन) chitosan फिल्मों की सतह पर सेल लगाव में सुधार करना है। ऐतिहासिक, क्रोमैटोग्राफी और एमिनो एसिड विश्लेषण grafted पेप्टाइड की राशि का एक सीधा माप प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, तेजी से जुदाई और सीई द्वारा प्रदान नमूना तैयार करने की अनुपस्थिति पेप्टाइड ग्राफ्टिंग की प्रक्रिया का भी उतना ही सटीक अभी तक वास्तविक समय की निगरानी में सक्षम बनाता है। सीई अलग और प्रतिक्रिया मिश्रण के विभिन्न घटकों यों करने में सक्षम है: (गैर grafted) पेप्टाइड और रासायनिक युग्मन एजेंट। इस रास्ते में सीई के उपयोग के बहाव के अनुप्रयोगों के लिए बेहतर फिल्मों में यह परिणाम है।
chitosan फिल्मों ठोस राज्य एनएमआर (परमाणु चुंबकीय अनुनाद) स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से विशेषता थे। इस तकनीक को और अधिक समय लेने वाली है और वास्तविक समय में लागू नहीं किया जा सकता है, लेकिन पेप्टाइड का एक सीधा माप पैदावार और इस तरह सीई तकनीक पुष्टि की।
Introduction
मुक्त समाधान केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) एक तकनीक है कि उनके आरोप को घर्षण अनुपात 1,2 के आधार पर समाधान में यौगिकों को अलग करती है। चार्ज करने के लिए आकार अनुपात अक्सर साहित्य में उल्लेख किया गया है, लेकिन इस सरलीकरण इस काम में polypeptides सहित polyelectrolytes पर लागू नहीं होता, और भी छोटे कार्बनिक अणुओं 3 के लिए उपयुक्त नहीं होना दिखाया गया था। सीई कि यह एक स्थिर चरण, केवल एक बैकग्राउंड इलेक्ट्रोलाइट (आमतौर पर एक बफर) के पास नहीं है अन्य जुदाई तकनीक से अलग है। इस तकनीक को इस तरह के संयंत्र फाइबर 5, किण्वन brews 6 सिंथेटिक पॉलिमर 7, 8 भोजन के नमूने, और शायद ही घुलनशील पेप्टाइड्स 9 थकाऊ नमूना तैयार करने के बिना और पर ग्राफ्टिंग के रूप में जटिल matrices 4 के साथ नमूनों की एक बड़ी रेंज का विश्लेषण करने की क्षमता में मजबूत होने की अनुमति देता शुद्धिकरण। यह जटिल polyelectrolytes (रों विघटन मुद्दों है जिसके लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैuch chitosan 10 और Gellan गम 11) और इसलिए के रूप में के रूप में एकत्रित या समाधान में उपजी मौजूद हैं और सफलतापूर्वक नमूना छानने का काम बिना विश्लेषण किया गया है। इसके अलावा, नाश्ता अनाज में शर्करा का विश्लेषण नाश्ता अनाज नमूनों के कणों के साथ नमूने इंजेक्शन लगाने के शामिल पानी 8 में उपजी। यह भी branched polyelectrolytes या copolymers 12,13 का विश्लेषण करने के लिए फैली हुई है। व्यापक काम भी विशेष रूप से प्रोटिओमिक्स 14, प्राकृतिक या सिंथेटिक पेप्टाइड्स 15 और प्रोटीन और पेप्टाइड्स 16 वर्ष की माइक्रोचिप विभाजन की अनुकृति अलग होने के लिए प्रोटीन का विश्लेषण के लिए सीई तकनीकों के विकास में पूरा हो चुका है। चूंकि जुदाई और विश्लेषण एक केशिका में जगह ले, नमूना की ही छोटी मात्रा और सॉल्वैंट्स उपयोग किया जाता है जो क्रोमैटोग्राफी 5,6,17 सहित अन्य जुदाई तकनीक की तुलना में कम लागत चल रहा है करने के लिए सीई सक्षम बनाता है। चूंकि सीई से जुदाई तेज है, यह monito की अनुमति देता हैप्रतिक्रिया कैनेटीक्स की अंगूठी। इस सुधार कोशिका आसंजन 18 के लिए chitosan फिल्मों पर पेप्टाइड्स की कलम बांधने का काम के मामले में प्रदर्शन किया गया।
Chitosan एक polysaccharide काइटिन के एन -deacetylation से प्राप्त होता है। Chitosan फिल्मों में इस तरह के विभिन्न जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में 19 bioadhesives और सेल के विकास substrates 18,20, chitosan के biocompatibility 21 की वजह से। ऐसे फ़ाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन और laminin के रूप में विशिष्ट बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन, करने के लिए सेल लगाव, सीधे कोशिकाओं 22 के अस्तित्व से जुड़ा हुआ है। विशेष रूप से, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं अक्सर अस्तित्व और समुचित कार्य के लिए विभिन्न बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के लिए कुर्की की आवश्यकता होती है। Chitosan फिल्मों के लिए सेल लगाव फ़ाइब्रोनेक्टिन 23 की ग्राफ्टिंग के माध्यम से बढ़ाया जा करने के लिए दिखाया गया था; हालांकि, तैयारी, शुद्धि और इस तरह के बड़े प्रोटीन की ग्राफ्टिंग के आर्थिक रूप से व्यवहार्य नहीं है। वैकल्पिक रूप से छोटे पेप्टाइड की एक सीमा के हवलदारई बड़े बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के गुणों की नकल करने में सक्षम होना दिखाया गया। उदाहरण के लिए, इस तरह के फ़ाइब्रोनेक्टिन mimetics RGD के रूप में पेप्टाइड (arginine – ग्लाइसिन – aspartic एसिड) और RGDS (arginine – ग्लाइसिन – aspartic एसिड – सेरीन) की सुविधा और सेल लगाव 24 बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। Chitosan फिल्मों पर RGDS के सहसंयोजक ग्राफ्टिंग विवो 18 में फ़ाइब्रोनेक्टिन को संलग्न करने के लिए जाना जाता कोशिकाओं के लिए बेहतर सेल लगाव में हुई। बड़ा प्रोटीन स्थानापन्न छोटे पेप्टाइड्स है कि एक ही कार्यक्षमता एक महत्वपूर्ण लागत में कमी प्रदान करता है के साथ फ़ाइब्रोनेक्टिन पसंद करता है।
इधर, पेप्टाइड chitosan को बांधने का काम के रूप में पहले 18 में प्रकाशित किया गया था। पहले प्रदर्शन के रूप में, इस दृष्टिकोण RGDS की कार्बोक्जिलिक एसिड functionalize पहले होना युग्मन एजेंट ईडीसी एचसीएल (1-इथाइल-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) और एन एच एस (एन -hydroxysuccinimide) का उपयोग करके सरल और कुशल ग्राफ्टिंग प्रदान करता है पर ग्राफ्टchitosan फिल्म। इस ग्राफ्टिंग विधि के दो फायदे है कि यह chitosan के या पेप्टाइड के किसी भी संशोधन की आवश्यकता नहीं होती हैं, और यह भविष्य सेल संस्कृति अनुप्रयोगों 18,20 के साथ अनुकूलता को अधिकतम करने के जलीय माध्यम में किया जाता है। युग्मन एजेंटों और पेप्टाइड का आरोप लगाया जा सकता है, सीई प्रतिक्रिया कैनेटीक्स के विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त तरीका है। महत्वपूर्ण बात है, सीई के माध्यम से प्रतिक्रिया कैनेटीक्स के विश्लेषण ग्राफ्टिंग प्रतिक्रिया के वास्तविक समय की निगरानी में सक्षम बनाता है, और इस तरह दोनों के अनुकूलन और ग्राफ्टिंग की डिग्री बढ़ाता सक्षम बनाता है।
हालांकि यह नियमित रूप से आवश्यक नहीं है, सीई विश्लेषण के परिणाम सहसंयोजक कलम बांधने का काम प्रदर्शित करने के लिए पेप्टाइड ठोस राज्य एनएमआर (परमाणु चुंबकीय अनुनाद) स्पेक्ट्रोस्कोपी 25,26 का उपयोग कर chitosan फिल्मों पर ग्राफ्टिंग का प्रत्यक्ष माप द्वारा बंद लाइन मान्य किया जा सकता फिल्म 18 पर पेप्टाइड की। हालांकि, ठोस राज्य एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ तुलना में वास्तविक समय विश्लेषण द्वारा उपलब्ध कराए गएसीई वास्तविक समय में पेप्टाइड की खपत और इस प्रकार की प्रतिक्रिया के कैनेटीक्स आकलन करने की क्षमता की मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है।
ऊपर वर्णित विधि सरल है और ग्राफ्टिंग की हद तक का अप्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव के साथ chitosan फिल्मों पर ग्राफ्टिंग पेप्टाइड का वास्तविक समय विश्लेषण की अनुमति देता है। प्रदर्शन विधि अलग रासायनिक प्रतिक्रियाओं के रूप में लंबे समय के रूप अभिकारकों या उत्पादों विश्लेषण किया जा चार्ज किया जा सकता का वास्तविक समय मात्रात्मक आकलन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल की सादगी यह आदर्श बड़े पैमाने पर आवेदन करने के लिए अनुकूल बनाता है। हालांकि, विशेष रूप से ध्यान निम्नलिखित महत्वपूर्ण कदम के लिए भुगतान किया जाना चाहिए।
समुचित सा?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG, MO’C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Hervé Cottet (Montpellier) for discussions.
Materials
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid – Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| RGDS | Bachem | H‐1155 | peptide, bought from Auspep Pty Ltd |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride – Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate – Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate – Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid – Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
- Muthukumar, M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. Electrophoresis. 17, 1167-1172 (1996).
- Barrat, J. L., Joanny, J. F. . in Advances in Chemical Physics, Vol Xciv Vol. 94 Advances in Chemical Physics. , 1-66 (1996).
- Fu, S. L., Lucy, C. A. Prediction of electrophoretic mobilities. 1. Monoamines. Anal. Chem. 70, 173-181 (1998).
- Harvey, D. . Modern Analytical Chemistry. , (2000).
- Oliver, J. D., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust determination of monosaccharides in plant fibers in complex mixtures by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1291, 179-186 (2013).
- Oliver, J. D., Sutton, A. T., Karu, N., Phillips, M., Markham, J., Peiris, P., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust monitoring of ethanol fermentations by capillary electrophoresis. Biotechnology and Applied Biochemistry. 62, 329-342 (2015).
- Thevarajah, J. J., Sutton, A. T., Maniego, A. R., Whitty, E. G., Harrisson, S., Cottet, H., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantifying the Heterogeneity of Chemical Structures in Complex Charged Polymers through the Dispersity of Their Distributions of Electrophoretic Mobilities or of Compositions. Anal. Chem. 88, 1674-1681 (2016).
- Toutounji, M. R., Van Leeuwen, M. P., Oliver, J. D., Shrestha, A. K., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantification of sugars in breakfast cereals using capillary electrophoresis. Carbohydr. Res. 408, 134-141 (2015).
- Miramon, H., Cavelier, F., Martinez, J., Cottet, H. Highly Resolutive Separations of Hardly Soluble Synthetic Polypeptides by Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 82, 394-399 (2010).
- Mnatsakanyan, M., Thevarajah, J. J., Roi, R. S., Lauto, A., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6873-6877 (2013).
- Taylor, D. L., Ferris, C. J., Maniego, A. R., Castignolles, P., in het Panhuis, M., Gaborieau, M. Characterization of Gellan Gum by Capillary Electrophoresis. Australian Journal of Chemistry. 65, 1156-1164 (2012).
- Thevarajah, J. J., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation and characterization of synthetic polyelectrolytes and polysaccharides with capillary electrophoresis. Adv. Chem. 2014, 798503 (2014).
- Sutton, A. T., Read, E., Maniego, A. R., Thevarajah, J., Marty, J. -. D., Destarac, M., Gaborieau, M., Castignolles, P. Purity of double hydrophilic block copolymers revealed by capillary electrophoresis in the critical conditions. J. Chromatogr. A. 1372, 187-195 (2014).
- Righetti, P. G., Sebastiano, R., Citterio, A. Capillary electrophoresis and isoelectric focusing in peptide and protein analysis. Proteomics. 13, 325-340 (2013).
- Ali, I., Al-Othman, Z. A., Al-Warthan, A., Asnin, L., Chudinov, A. Advances in chiral separations of small peptides by capillary electrophoresis and chromatography. J. Sep. Sci. 37, 2447-2466 (2014).
- Kasicka, V. Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013). Electrophoresis. 35, 69-95 (2014).
- Taylor, D. L., Thevarajah, J. J., Narayan, D. K., Murphy, P., Mangala, M. M., Lim, S., Wuhrer, R., Lefay, C., O’Connor, M. D., Gaborieau, M., Castignolles, P. Real-time monitoring of peptide grafting onto chitosan films using capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 407, 2543-2555 (2015).
- Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603-632 (2006).
- Li, Z., Leung, M., Hopper, R., Ellenbogen, R., Zhang, M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31, 404-412 (2010).
- Domard, A. A perspective on 30 years research on chitin and chitosan. Carbohydr. Polym. 84, 696-703 (2011).
- Shekaran, A., Garcia, A. J. Nanoscale engineering of extracellular matrix-mimetic bioadhesive surfaces and implants for tissue engineering. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1810, 350-360 (2011).
- Custodio, C. A., Alves, C. M., Reis, R. L., Mano, J. F. Immobilization of fibronectin in chitosan substrates improves cell adhesion and proliferation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 316-323 (2010).
- Boateng, S. Y., Lateef, S. S., Mosley, W., Hartman, T. J., Hanley, L., Russell, B. RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C30-C38 (2005).
- Lefay, C., Guillaneuf, Y., Moreira, G., Thevarajah, J. J., Castignolles, P., Ziarelli, F., Bloch, E., Major, M., Charles, L., Gaborieau, M., Bertin, D., Gigmes, D. Heterogeneous modification of chitosan via nitroxide-mediated polymerization. Polym. Chem. 4, 322-328 (2013).
- Gartner, C., Lopez, B. L., Sierra, L., Graf, R., Spiess, H. W., Gaborieau, M. Interplay between Structure and Dynamics in Chitosan Films Investigated with Solid-State NMR, Dynamic Mechanical Analysis, and X-ray Diffraction. Biomacromolecules. 12, 1380-1386 (2011).
- Castignolles, P., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Sprong, E., Ferguson, C. J., Gilbert, R. G. High resolution separation of oligo(acrylic acid) by capillary zone electrophoresis. Macromol. Rapid Commun. 27, 42-46 (2006).
- Chamieh, J., Martin, M., Cottet, H. Quantitative Analysis in Capillary Electrophoresis: Transformation of Raw Electropherograms into Continuous Distributions. Anal. Chem. 87, 1050-1057 (2015).
- Maniego, A. R., Ang, D., Guillaneuf, Y., Lefay, C., Gigmes, D., Aldrich-Wright, J. R., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of poly(acrylic acid) salts according to topology using capillary electrophoresis in the critical conditions. Anal. Bioanal. Chem. 405, 9009-9020 (2013).
- Chung, T. W., Lu, Y. F., Wang, S. S., Lin, Y. S., Chu, S. H. Growth of human endothelial cells on photochemically grafted Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) chitosans. Biomaterials. 23, 4803-4809 (2002).
