모세관 전기 영동은 실시간으로 키토산 필름에 펩타이드 접목을 모니터링하는
Summary
Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.
Abstract
프리 용액을 모세관 전기 영동 (CE)은 전계의인가를 통해 용액 분석, 일반적으로 충전 된 화합물을 분리한다. 크로마토 그래피와 같은 다른 분석 분리 기술에 비해, CE 강력한, 저렴하고 효율적으로 (복잡한 자연 행렬 또는 중합체 샘플의 수에 대한) 어떤 샘플 준비가 필요하지 않습니다. CE는 빠르게 분리 된 화합물에 대해 관찰 된 신호는 용액에서의 양에 정비례로 실시간 (예를 들어, 화학 반응 속도)의 혼합물의 방출을 수행하기 위해 사용될 수있다.
여기서, CE 효율이 후속 생의학 애플리케이션 키토산 필름 상 펩티드의 공유 래프팅 모니터링 설명된다. 키토산의 항균 및 생체 특성은 이러한 세포 성장 기판 등 생물 의학 응용 프로그램에 대한 매력적인 소재 확인합니다. 공유 RGDS 펩티드를 (그 래프팅 아르기닌 – 글리신 -아스파르트 산 – 세린) 키토산 필름의 표면에 세포 부착을 향상시키는 것을 목적으로한다. 역사적으로, 크로마토 그래피 및 아미노산 분석 그래프트 펩티드의 양을 직접 측정을 제공하기 위해 사용되어왔다. 그러나 CE 제공하는 샘플 제제의 신속한 분리 부재 펩티드 래프팅 방법의 균등하면서도 정확한 실시간 모니터링을 가능하게한다. CE 분리는 반응 혼합물의 다른 구성 요소를 정량화 할 수있다 : 제 (비 그래프트) 펩타이드와 화학적 커플 링제. 이러한 방식으로 CE의 사용은 하류 어플리케이션에 개선 된 필름을 초래한다.
키토산 필름은 고체 NMR (핵 자기 공명) 분광법을 특징으로 하였다. 이 기술은 많은 시간이 걸린다 실시간으로 적용 할 수 있지만, 펩티드의 직접적인 측정치를 산출하고, 따라서 CE 기술을 검증한다.
Introduction
무료 용액 모세관 전기 영동 (CE)는 그 전하로 마찰 비율 1.2에 기반 솔루션의 화합물을 분리하는 기술이다. 충전 – 투 – 크기 비율은 종종 문헌에 언급되어 있지만,이 단순화는이 작품에서 폴리 펩타이드를 포함하여, 고분자 전해질에 적용되지 않습니다, 또한 작은 유기 분자 3에 적합하지 줬습니다. CE는 정지상 만 배경 전해질 (통상 버퍼)를 갖고 있지 않는 다른 분리 기술과 다르다. 이 기술은 5, 발효 양조주 6 합성 중합체 7 음식 샘플 8 지루한 샘플 준비없이 거의 용해 펩티드 (9) 상에 이식 식물 섬유 등의 복잡한 매트릭스 (4) 샘플의 넓은 범위를 분석 할 수있는 능력의 견고 할 수 정화. 이 용해 문제가 복잡한 고분자 전해질 (들에 특히 중요하다UCH 따라서 키토산 (10)와 젤란 검 11) 및뿐만 집계 또는 용액에 침전 존재하고 성공적으로 샘플 여과없이 분석되고있다. 또한, 아침 시리얼에 설탕의 분석 물 (8)에 침전 아침 시리얼 샘플의 입자 샘플을 주입하고있었습니다. 이것은 또한 분기 고분자 전해질 또는 공중 합체 (12, 13)의 분석을 확장합니다. 많은 작업은 특별히 프로테오믹스 (14), 천연 또는 합성 펩티드 15, 단백질 및 펩티드 (16)의 마이크로 칩 분리의 키랄 분리를위한 단백질의 CE 분석 기술의 개발에 완성되었다. 분리 및 분석 모세관 일어날 때문에, 단지 작은 샘플 볼륨과 용매 크로마토 5,6,17 포함한 다른 분리 기술보다 낮은 운전 비용이 CE 할 수있게하는 데 사용된다. CE 분리하여 고속이기 때문에,이 과정 제어를 허용반응 속도의 반지. 이는 개선 된 세포 부착 18 키토산 필름 상 펩티드의 이식의 경우에서 설명 하였다.
키토산은 키틴의 N의 -deacetylation 유래의 다당류이다. 키토산의 생체 적합성으로 인해 21, 18, 20 19 생체 접착제 및 세포 증식 기질로서 키토산 필름 등 다양한 생물 의학 응용에 사용될 수있다. 피브로넥틴, 콜라겐 및 라미닌 등의 특정 세포 외 기질 단백질에 대한 세포 부착은 직접 셀 (22)의 생존에 연결된다. 특히, 다른 세포 유형은 종종 생존과 적절한 기능에 대해 서로 다른 세포 외 기질 단백질에 부착이 필요합니다. 키토산 필름에 세포 부착은 피브로넥틴 (23)의 접목을 통해 개선 된 것으로 나타났다; 그러나, 제조, 정제 및 대형 단백질의 접목은 경제적으로 실행되지 않습니다. 대안 작은 펩타이드의 범위는 근래E는 많은 세포 외 기질 단백질의 특성을 모방 할 수있는 것으로 나타났다. 예를 들어, 피브로넥틴의 모방 체로서 RGD 펩티드 (아르기닌 – 글리신 – 아스파르트 산) 및 RGDS (아르기닌 – 글리신 – 아스파라긴산 – 세린)을 촉진하고 세포 부착 (24)을 증가시키는 데 사용되어왔다. 키토산 필름 상에 RGDS의 공유 이식은 생체 내 18 피브로넥틴에 연결하는 것으로 알려진 세포에 대한 향상된 세포 부착 결과. 더 큰 단백질을 대체하는 것은 동일한 기능은 상당한 비용 절감을 제공이 작은 펩티드 피브로넥틴을 추천.
이전 18 공표 여기서, 키토산 래프팅 펩티드 하였다. 이미 증명 된 바와 같이, 이러한 접근법은되도록 RGDS의 카복실산 기능화 할 커플 링제 EDC-HCl을 (1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필 ) 카 보디이 미드 ) 및 NHS (N의 -hydroxysuccinimide)를 이용하여 간편하고 효율적으로 식립을 제공 에 이식키토산 필름. 이 래프팅 방법의 두 가지 장점은 키토산 또는 펩티드의 임의의 변형을 필요로하지 않는다는 점이며, 이는 향후의 세포 배양 애플리케이션 (18, 20)과의 호환성을 극대화하는 수성 매질에서 수행된다. 커플 링제와 펩티드가 충전 될 수있는 바와 같이, CE 반응 동력학의 분석에 적합한 방법이다. 중요한 CE 통해 반응 속도 분석 래프팅 반응의 실시간 모니터링을 가능하게하고, 따라서 모두 최적화 래프팅 정도를 정량 할 수 있습니다.
그것은 통상적으로 필요하지 않다하지만, CE 분석 결과는 공유 래프팅을 입증 고체 NMR (핵 자기 공명) 분광학 25, 26를 사용하여 키토산의 필름 상에 그 래프팅 펩타이드의 직접 측정에 의해 오프라인으로 확인 될 수있다 막 (18) 상에 펩타이드. 그러나, 고체 상태 NMR 분광법에 비해 실시간 분석을 제공CE 실시간 펩티드 소모와 반응의 동역학을 평가하는 것이 기능의 정량화 할 수있다.
상술 한 방법은 간단하고, 그 래프팅 정도 간접 정량 키토산 필름 상에 그 래프팅 펩티드를 실시간으로 분석 할 수있다. 입증 된 방법은 다른 화학적 반응만큼 반응물 또는 충전 할 수있는 분석하고자하는 제품의 실시간 정량적 평가로 확장 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜의 단순함은 광범위한 애플리케이션에 이상적으로 적합하다. 그러나, 특별한주의는 다음과 같은 주요 단계에 지불해야합니다.
적절한 CE 악기 준비
이는 하루에 모세관 및 기기의 정당성을 확인하는 미지 시료의 분리 직전에 공지 된 표준 (뿐만 아니라 분리의 일련의 끝)를 분리하는 것이 중요하다. 이 표준은 oligoacr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG, MO’C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Hervé Cottet (Montpellier) for discussions.
Materials
| Water | Millipore | All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality | |
| Chitosan powder (medium molecular weight) | Sigma-Aldrich | 448877 | lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides |
| Acetic acid – Unilab | Ajax Finechem | 2-2.5L GL | laboratory reagent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | laboratory reagent, corrosive |
| RGDS | Bachem | H‐1155 | peptide, bought from Auspep Pty Ltd |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | Irritant to skin |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | Irritant to skin |
| Sodium chloride | Ajax Finechem | 466-500G | laboratory reagent |
| Potassium chloride – Univar | Ajax Finechem | 384-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Disodium hydrogen phosphate – Unilab | Ajax Finechem | 1234-500G | laboratory reagent, slight skin irritant |
| Potassium dihydrogen phosphate – Univar | Ajax Finechem | 4745-500G | analytical reagent, slight skin irritant |
| Oligoacrylate standard | custom made | See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46 | |
| Boric acid | BDH AnalR, Merck Pty Ltd | 10058 | Corrosive |
| Hydrochloric acid – Unilab | Ajax Finechem | A1367-2.5L | laboratory reagent, corrosivie |
| Fused silica tubing | Polymicro (Molex) | TSP050375 | Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter |
| Agilent 7100 CE | Agilent Technologies | G7100CE | Capillary electrophoresis instrument |
| Orbital shaker | IKA | KS260 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo | MS204S | |
| Milli-Q Synthesis | Millipore | ZMQS5VF01 | Ultrapure water filtration system |
| Parafilm | Labtek | PM966 | Parrafin wax |
References
- Muthukumar, M. Theory of electrophoretic mobility of a polyelectrolyte in semidilute solutions of neutral polymers. Electrophoresis. 17, 1167-1172 (1996).
- Barrat, J. L., Joanny, J. F. . in Advances in Chemical Physics, Vol Xciv Vol. 94 Advances in Chemical Physics. , 1-66 (1996).
- Fu, S. L., Lucy, C. A. Prediction of electrophoretic mobilities. 1. Monoamines. Anal. Chem. 70, 173-181 (1998).
- Harvey, D. . Modern Analytical Chemistry. , (2000).
- Oliver, J. D., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust determination of monosaccharides in plant fibers in complex mixtures by capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1291, 179-186 (2013).
- Oliver, J. D., Sutton, A. T., Karu, N., Phillips, M., Markham, J., Peiris, P., Hilder, E. F., Castignolles, P. Simple and robust monitoring of ethanol fermentations by capillary electrophoresis. Biotechnology and Applied Biochemistry. 62, 329-342 (2015).
- Thevarajah, J. J., Sutton, A. T., Maniego, A. R., Whitty, E. G., Harrisson, S., Cottet, H., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantifying the Heterogeneity of Chemical Structures in Complex Charged Polymers through the Dispersity of Their Distributions of Electrophoretic Mobilities or of Compositions. Anal. Chem. 88, 1674-1681 (2016).
- Toutounji, M. R., Van Leeuwen, M. P., Oliver, J. D., Shrestha, A. K., Castignolles, P., Gaborieau, M. Quantification of sugars in breakfast cereals using capillary electrophoresis. Carbohydr. Res. 408, 134-141 (2015).
- Miramon, H., Cavelier, F., Martinez, J., Cottet, H. Highly Resolutive Separations of Hardly Soluble Synthetic Polypeptides by Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 82, 394-399 (2010).
- Mnatsakanyan, M., Thevarajah, J. J., Roi, R. S., Lauto, A., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of chitosan by degree of acetylation using simple free solution capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 405, 6873-6877 (2013).
- Taylor, D. L., Ferris, C. J., Maniego, A. R., Castignolles, P., in het Panhuis, M., Gaborieau, M. Characterization of Gellan Gum by Capillary Electrophoresis. Australian Journal of Chemistry. 65, 1156-1164 (2012).
- Thevarajah, J. J., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation and characterization of synthetic polyelectrolytes and polysaccharides with capillary electrophoresis. Adv. Chem. 2014, 798503 (2014).
- Sutton, A. T., Read, E., Maniego, A. R., Thevarajah, J., Marty, J. -. D., Destarac, M., Gaborieau, M., Castignolles, P. Purity of double hydrophilic block copolymers revealed by capillary electrophoresis in the critical conditions. J. Chromatogr. A. 1372, 187-195 (2014).
- Righetti, P. G., Sebastiano, R., Citterio, A. Capillary electrophoresis and isoelectric focusing in peptide and protein analysis. Proteomics. 13, 325-340 (2013).
- Ali, I., Al-Othman, Z. A., Al-Warthan, A., Asnin, L., Chudinov, A. Advances in chiral separations of small peptides by capillary electrophoresis and chromatography. J. Sep. Sci. 37, 2447-2466 (2014).
- Kasicka, V. Recent developments in capillary and microchip electroseparations of peptides (2011-2013). Electrophoresis. 35, 69-95 (2014).
- Taylor, D. L., Thevarajah, J. J., Narayan, D. K., Murphy, P., Mangala, M. M., Lim, S., Wuhrer, R., Lefay, C., O’Connor, M. D., Gaborieau, M., Castignolles, P. Real-time monitoring of peptide grafting onto chitosan films using capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 407, 2543-2555 (2015).
- Rinaudo, M. Chitin and chitosan: Properties and applications. Prog. Polym. Sci. 31, 603-632 (2006).
- Li, Z., Leung, M., Hopper, R., Ellenbogen, R., Zhang, M. Feeder-free self-renewal of human embryonic stem cells in 3D porous natural polymer scaffolds. Biomaterials. 31, 404-412 (2010).
- Domard, A. A perspective on 30 years research on chitin and chitosan. Carbohydr. Polym. 84, 696-703 (2011).
- Shekaran, A., Garcia, A. J. Nanoscale engineering of extracellular matrix-mimetic bioadhesive surfaces and implants for tissue engineering. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1810, 350-360 (2011).
- Custodio, C. A., Alves, C. M., Reis, R. L., Mano, J. F. Immobilization of fibronectin in chitosan substrates improves cell adhesion and proliferation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 316-323 (2010).
- Boateng, S. Y., Lateef, S. S., Mosley, W., Hartman, T. J., Hanley, L., Russell, B. RGD and YIGSR synthetic peptides facilitate cellular adhesion identical to that of laminin and fibronectin but alter the physiology of neonatal cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 288, C30-C38 (2005).
- Lefay, C., Guillaneuf, Y., Moreira, G., Thevarajah, J. J., Castignolles, P., Ziarelli, F., Bloch, E., Major, M., Charles, L., Gaborieau, M., Bertin, D., Gigmes, D. Heterogeneous modification of chitosan via nitroxide-mediated polymerization. Polym. Chem. 4, 322-328 (2013).
- Gartner, C., Lopez, B. L., Sierra, L., Graf, R., Spiess, H. W., Gaborieau, M. Interplay between Structure and Dynamics in Chitosan Films Investigated with Solid-State NMR, Dynamic Mechanical Analysis, and X-ray Diffraction. Biomacromolecules. 12, 1380-1386 (2011).
- Castignolles, P., Gaborieau, M., Hilder, E. F., Sprong, E., Ferguson, C. J., Gilbert, R. G. High resolution separation of oligo(acrylic acid) by capillary zone electrophoresis. Macromol. Rapid Commun. 27, 42-46 (2006).
- Chamieh, J., Martin, M., Cottet, H. Quantitative Analysis in Capillary Electrophoresis: Transformation of Raw Electropherograms into Continuous Distributions. Anal. Chem. 87, 1050-1057 (2015).
- Maniego, A. R., Ang, D., Guillaneuf, Y., Lefay, C., Gigmes, D., Aldrich-Wright, J. R., Gaborieau, M., Castignolles, P. Separation of poly(acrylic acid) salts according to topology using capillary electrophoresis in the critical conditions. Anal. Bioanal. Chem. 405, 9009-9020 (2013).
- Chung, T. W., Lu, Y. F., Wang, S. S., Lin, Y. S., Chu, S. H. Growth of human endothelial cells on photochemically grafted Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) chitosans. Biomaterials. 23, 4803-4809 (2002).
