Kapillær elektroforese til Monitor Peptide Negl på Chitosan Filmer i sanntid

Summary

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

Abstract

Fri-oppløsning kapillær elektroforese (CE) skiller analytter, vanligvis ladede forbindelser i oppløsning ved anvendelse av et elektrisk felt. Sammenlignet med andre analytiske separasjonsteknikker, så som kromatografi, er CE billig, robust og effektivt krever ingen prøvepreparering (for en rekke komplekse naturlige matrikser eller polymere prøver). CE er rask og kan brukes til å følge utviklingen av blandinger i sanntid (f.eks kjemisk reaksjonskinetikk), som signalene observert for de separerte forbindelsene er direkte proporsjonal med deres mengde i oppløsning.

Her blir effektiviteten av CE vist for overvåking av kovalent poding av peptider på kitosan filmer for etterfølgende biomedisinske anvendelser. Chitosan er antimikrobielle og biokompatible egenskaper gjør det til et attraktivt materiale for biomedisinske applikasjoner som cellevekst underlag. Kovalent pode peptid RGDS (arginin – glysin -asparaginsyre – serin) på overflaten av kitosan filmer tar sikte på å forbedre cellefesting. Historisk, kromatografi og aminosyreanalyse har vært brukt til å gi en direkte måling av mengden av podet peptid. Men den raske separasjon og fravær av prøveopparbeidelse levert av CE gjør like nøyaktig, men sanntids overvåking av peptidet pode prosessen. CE er i stand til å separere og kvantifisere de forskjellige komponenter i reaksjonsblandingen: den (ikke podet) peptid, og de kjemiske koblingsmidler. På denne måte kan bruk av CE resulterer i forbedrede filmer for nedstrømsapplikasjoner.

Chitosan Filmene ble karakterisert ved fast tilstand NMR (kjernemagnetisk resonans) spektroskopi. Denne teknikken er mer tidkrevende og kan ikke brukes i sann tid, men gir en direkte måling av peptidet og således validerer CE teknikk.

Introduction

Gratis løsning kapillær elektroforese (CE) er en teknikk som skiller forbindelser i løsninger basert på deres kostnad-til-friksjon ratio ^1,2. Charge-til-size-forholdet er ofte nevnt i litteraturen, men denne forenklingen gjelder ikke polyelektrolytter, herunder polypeptider i dette arbeidet, og ble også vist å være passende for små organiske molekyler ^3. CE skiller seg fra andre separasjonsteknikker ved at den ikke har en stasjonær fase, bare en bakgrunnselektrolytt (vanligvis en buffer). Dette gjør at teknikken for å være robust i sin evne til å analysere et stort utvalg av prøver med komplekse matriser ⁴ som plantefibre ^5, gjæring trakter ⁶ poding på syntetiske polymerer ^7, matvareprøver ^8, og knapt oppløselige peptider ⁹ uten tidkrevende prøvepreparering og rensing. Dette er spesielt viktig for komplekse polyelektrolytter som har oppløsningsproblemer (rUCH som kitosan ¹⁰ og gellangummi ¹¹⁾ og eksisterer derfor som aggregert og utfelt i oppløsning og har blitt analysert uten prøve filtrering. Videre analyse av sukker i frokostblandinger involvert injisere prøver med partikler av frokostblanding prøver utfelt i vann ^8. Dette strekker seg også til analysen av forgrenede polyelektrolytter eller kopolymerer ^12,13. Omfattende arbeid har også blitt gjennomført i utviklingen av CE teknikker spesielt for analyse av proteiner for proteomikk ^14, kiralt separasjon av naturlige eller syntetiske peptider ¹⁵ og microchip separasjoner av proteiner og peptider ^16. Etter separasjon og analyse finner sted i et kapillar, er bare små volumer av prøve og oppløsningsmidler brukes som muliggjør CE for å ha en lavere driftskostnader enn andre separasjonsteknikker, inkludert kromatografi ^5,6,17. Siden separasjon ved CE er rask, gjør det industriering av reaksjonskinetikk. Dette ble demonstrert i tilfelle av podingen av peptider på kitosan filmer for forbedret celleadhesjon ^18.

Chitosan er et polysakkarid som stammer fra den N -deacetylation av kitin. Chitosan filmer kan anvendes for forskjellige biomedisinske anvendelser slik som bioadhesiver ¹⁹ og celledyrkingsunderlag ^18,20, på grunn av kitosan er biokompatibilitet ^21. Cellebinding til spesifikke ekstracellulære matriseproteiner, så som fibronektin, kollagen og laminin, er direkte knyttet til overlevelse av cellene ^22. Spesielt, ulike celletyper krever ofte tilknytning til forskjellige ekstracellulære matrix proteiner for å overleve og riktig funksjon. Cellebinding til kitosan filmer viste seg å bli forbedret ved poding av fibronektin ^23; men er forberedelse, rensing og poding av slike store proteiner ikke økonomisk forsvarlig. Alternativt en rekke små peptider have vist seg å være i stand til å etterligne egenskapene til store ekstracellulære matriksproteiner. For eksempel, peptider så som fibronektin-mimetika RGD (arginin – glycin – asparaginsyre) og RGDS (arginin – glycin – asparaginsyre – serin) har blitt brukt for å lette og øke cellefesting ^24. Kovalent poding av RGDS ut mot kitosan filmer resultert i forbedret cellebinding for celler som er kjent for å feste til fibronektin in vivo ^18. Erstatte større proteiner liker fibronektin med mindre peptider som har samme funksjonalitet gir en betydelig kostnadsreduksjon.

Her, peptid poding til kitosan ble utført som tidligere utgitt ^18. Som tidligere vist, gir denne fremgangsmåten enkel og effektiv poding ved hjelp av koblingsmidler EDC-HCl (1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid) og NHS (N-hydroksysuccinimid) for å funksjonalisere karboksylsyren av RGDS å være podet påkitosan film. To fordeler ved denne podefremgangsmåten er at den ikke krever noen modifikasjon av chitosan eller av peptidet, og det er foretatt i vandig medium for å maksimere kompatibilitet med fremtidige cellekultur anvendelser ^18,20. Som koblingsmidler og peptidet kan lades, er CE en egnet metode for analyse av reaksjonskinetikken. Viktigere, analyse av reaksjonskinetikken via CE muliggjør sanntidsovervåking av pode reaksjon, og dermed gjør det mulig både å optimalisere og kvantifisere graden av pode.

Selv om det ikke er rutinemessig er nødvendig, kan resultatene av CE-analyse valideres off-line ved en direkte måling av peptidet poding på kitosan filmene ved hjelp av faststoff NMR (kjernemagnetisk resonans) spektroskopi ^25,26 for å demonstrere den kovalente pode av peptidet på filmen ^18. Men sammenlignet med faststoff-tilstand NMR-spektroskopi, analyse av sanntids levert avCE muliggjør kvantifisering av peptidet forbruk i sanntid, og dermed evnen til å vurdere reaksjonskinetikken.

Den ovennevnte metode er enkel og gjør det mulig for sanntids analyse av peptid poding på kitosan filmer med indirekte kvantifisering av graden av poding. Den viste metode kan utvides til den virkelige tid kvantitativ vurdering av forskjellige kjemiske reaksjoner så lenge reaktantene eller produktene som skal analyseres kan belastes.

Protocol

1. Utarbeidelse av Chitosan Films Vei ut 2 g iseddik, fullstendig til 100 ml med ultrarent vann. Vei opp 1,7 g av kitosan pulver, tilsett 100 ml av 2% m / m vandig eddiksyreoppløsning. Omrør i 5 dager med rørestav og magnetrører ved romtemperatur enten dekket med aluminiumsfolie eller i mørket. Sentrifuger chitosandispersjonen ved 1076 xg ved 23 ° C i 1 time. Samle opp supernatanten med en sprøyte og kast bunnfallet. For hver film, alikvoter 10 ml av kitosan suspensjonen i…

Representative Results

CE er godt egnet til overvåking av poding av peptider (f.eks RGDS) på kitosan filmer. Egnede koblingsmidler omfatter EDC-HCl og NHS som aktiverer peptidet som skal podes på chitosan (figur 1). CE er i stand til å skille de forskjellige molekyler av interesse fra reaksjonsmediet. For å tildele toppene på elektroferogrammet, rene RGDS, EDC-HCl og NHS ble oppløst, injisert og separert separat. Etter at topp oppdraget, ble reaksjonsmediet injisert og de forsk…

Discussion

Enkelheten av protokollen beskrevet her gjør den ideell til omfattende søknad. Men trenger spesiell oppmerksomhet rettes mot følgende viktige skritt.

Riktig CE instrument forberedelse

Det er viktig å skille en kjent standard umiddelbart før separeringen av ukjente prøver (så vel som ved enden av en serie separasjoner) for å kontrollere gyldigheten av kapillaren og instrumentet på dagen. Denne standarden kan være en oligoacrylate ^27…

Materials

Water	Millipore		All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality
Chitosan powder (medium molecular weight)	Sigma-Aldrich	448877	lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides
Acetic acid – Unilab	Ajax Finechem	2-2.5L GL	laboratory reagent
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	laboratory reagent, corrosive
RGDS	Bachem	H‐1155	peptide, bought from Auspep Pty Ltd
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide	Sigma-Aldrich	D80002	Irritant to skin
N-hydroxysuccinimide	Sigma-Aldrich	130672	Irritant to skin
Sodium chloride	Ajax Finechem	466-500G	laboratory reagent
Potassium chloride – Univar	Ajax Finechem	384-500G	analytical reagent, slight skin irritant
Disodium hydrogen phosphate – Unilab	Ajax Finechem	1234-500G	laboratory reagent, slight skin irritant
Potassium dihydrogen phosphate – Univar	Ajax Finechem	4745-500G	analytical reagent, slight skin irritant
Oligoacrylate standard	custom made		See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46
Boric acid	BDH AnalR, Merck Pty Ltd	10058	Corrosive
Hydrochloric acid – Unilab	Ajax Finechem	A1367-2.5L	laboratory reagent, corrosivie
Fused silica tubing	Polymicro (Molex)	TSP050375	Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter
Agilent 7100 CE	Agilent Technologies	G7100CE	Capillary electrophoresis instrument
Orbital shaker	IKA	KS260
Electronic balance	Mettler Toledo	MS204S
Milli-Q Synthesis	Millipore	ZMQS5VF01	Ultrapure water filtration system
Parafilm	Labtek	PM966	Parrafin wax