Adenofection: منهج في دراسة دور الجزيئية الوصيفات في الخلوي Morphodynamics من التجارب استنفاد الانقاذ
Summary
We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.
Abstract
تخضع العمليات الخلوية مثل الانقسام وتمايز الخلايا عن طريق التغييرات في شكل الخلية التي تعتمد إلى حد كبير على إعادة السليم للهياكل الخلية هيكل الخلية. وهذا ينطوي على التجميع تفكيك العليا الهياكل الجزيئات في وقت معين، والمكان، وهي عملية حساسة بشكل خاص للاضطرابات الناجمة عن overexpression من البروتينات. الأساليب التي يمكن الحفاظ على توازن بروتين والحفاظ على القصير وطبيعي التشكل الخلوي هي مرغوب فيه للغاية لتحديد مساهمة الوظيفية للبروتين من الفائدة في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية. عابرة التجارب استنزاف الانقاذ بناء على تدخل الحمض النووي الريبي هي نهج قوية لتحليل وظائف البروتين والمتطلبات الهيكلية. ومع ذلك، إعادة إدخال البروتين الهدف مع الحد الأدنى من الانحراف عن مستواه الفسيولوجية هو التحدي الحقيقي. نحن هنا وصف طريقة تسميته adenofection التي وضعت لدراسة دور الجزيئات المصاحبة لشركاء التطوير في التشغيل العادي للتقسيم الخلايا والعلاقة مع إعادة الأكتين. تم استنفاد خلايا هيلا من BAG3 مع الدوبلكس سيرنا تستهدف المنطقة 3'UTR. ويعيد البروتينات BAG3 الموسومة GFP في وقت واحد في> 75٪ من الخلايا باستخدام الفيروسات الغدية المؤتلف بالإضافة إلى الكواشف ترنسفكأيشن. Adenofection سكريبت لتتمكن من التعبير عن البروتينات BAG3-GFP في المستويات الفسيولوجية تقريبا في خلايا هيلا المنضب من BAG3، في ظل عدم وجود استجابة التوتر. لم يلاحظ أي تأثير على مستويات مرافقين بروتين الصدمة الحرارية الذاتية، المنظمين من الإجهاد محرض الرئيسية للتوازن البروتين. وعلاوة على ذلك، وذلك بإضافة baculoviruses القيادة التعبير عن علامات الفلورسنت في وقت خلية التنبيغ ترنسفكأيشن، يمكننا أن تشريح ديناميات الخلايا الإنقسامية التي كتبها المجهرية الوقت الفاصل بين يحلل مع الحد الأدنى من اضطراب التقدم الإنقسامية العادي. Adenofection ينطبق أيضا على خلايا فأر التي يصعب تصيب، ومناسبة للتحليلات وظيفية فرق بالخلايا العضلية الجذعيةerentiation إلى myotubes. وهكذا يوفر adenofection طريقة تنوعا لأداء هيكل الوظائف تحلل البروتينات المشاركة في العمليات البيولوجية الحساسة التي تعتمد على العليا ديناميات هيكل الخلية.
Introduction
تعطيل وظيفي في التعبير الجيني في خلايا الثدييات هو معيار الذهب لتشريح وظائف البروتين. وضعت حديثا تقنيات التحرير الجينوم على أساس استخدام nucleases مواقع محددة مثل nucleases الزنك الاصبع وتتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / CAS9 تسمح الآن جيل من خطوط الخلايا مع حذف الجينات المستهدفة وطفرة 1،2. وينبغي لهذه المناهج الجديدة ثورة في الطريقة التي ندرسها وظيفة البروتين وفهمنا لعلم الوراثة من الأمراض التي تصيب الإنسان. في بعض الحالات، ومع ذلك، على المدى الطويل أو بالضربة القاضية جين كامل غير مرغوب فيه وربما يثير آليات التعويض خلية الثانوية. جيل من خطوط الخلايا المعدلة وراثيا ويمكن أيضا أن يكون الحد عند التعامل مع الثقافات الخلية الأولية مع قدرة انتشار محدودة، أو عندما يطلب فحص مجموعة كبيرة من الطفرات في مختلف أنواع الخلايا. وغالبا ما تطلب الأمر ذلك لتحديد تبعية خلية بعملية iological على متطلبات الهيكلية للبروتين. تحقيقا لهذه الغاية، ضربة قاضية عكسها عن طريق تدخل الحمض النووي الريبي التي تمكن التجارب استنزاف الانقاذ عابرة في مختلف الخلفيات الخلوية لا تزال مقاربة بسيطة وقوية لأداء هيكل الوظائف تحلل بروتين من الفائدة 3. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي لهذا النهج هو صعوبة لتحقيق إسكات كفاءة ولإعادة البروتين من الفائدة أو مشتقاته في مستويات الفسيولوجية تقريبا في غالبية السكان الخلية. هذا أمر بالغ الأهمية لتمكين الدراسات الشاملة التي تحاول ربط آثار وظيفية ينظر على مستوى الخلايا واحد (النمط الظاهري hypomorphic) مع تلك التي ظهرت في المقايسات القائمة على السكان الخلية، على سبيل المثال على تفاعلات البروتين البروتين.
باستخدام أساليب ترنسفكأيشن الكلاسيكية، يمكن للمرء أن من الصعب تحقيق التعبير متجانسة وانخفاض البروتينات الخارجية في عدد كبير من الخلايا. تنبيغ من الخلايا التي تحتوي على فيروسات المؤتلفمثل الفيروسات الغدية في كثير من الأحيان يمكن التعبير أكثر طبيعية من البروتينات الخارجية. ومع ذلك فإن امتصاص اتش محدودة من قبل مستقبلات CAR، الذي هو غائب في خلايا غير بشرية أو فقط أعرب ضعيف في بعض أنواع الخلايا البشرية. وعلاوة على ذلك، فإن دخول الخلوي من الفيروسات الغدية ينشط مسارات الإشارات التي تنظم شكل الخلية والتصاق 4-6. ومن الواضح أن هذا غير مرغوب فيه عند دراسة الآليات التنظيمية morphodynamics الخلية. كنا في مواجهة هذه الإشكالية عندما قمنا بها تحليلات وظيفية مجمع كوصي، BAG3-HSPB8، في انقسام الخلايا وديناميات الأكتين. وكان العمل الرائد وصفت دور لهذا المجمع كوصي في مراقبة الجودة البروتين والالتهام الذاتي أثناء الإجهاد 7،8. معظم هذه الدراسات، ومع ذلك، تعتمد على overexpression البروتين، على افتراض أن المحرمين وupregulated عادة أثناء الإجهاد. وقد ترك هذا الباب مفتوحا أمام مسألة ما إذا كان BAG3، في مجمع مع HSPB8، يمكن أن تسهم في التشغيل العادي للتقسيم الخلايا معربا عن عشرمرافقين جنوب شرقي مثل العديد من أنواع الخلايا السرطانية 9. على وجه الخصوص، ما إذا كان مجمع كوصي يساهم في إعادة بناء الهياكل القائمة على الأكتين التي تتحكم في تطور الإنقسامية كانت ذات أهمية كبيرة، نظرا للصلات الناشئة بين المحرمين HSPB وديناميات هيكل الخلية 10. لمعالجة هذه المسألة، كنا نسعى إلى تطوير وسيلة فعالة للتجارب استنفاد الإنقاذ التي لن تتداخل مع تطور الإنقسامية أو التشكل الخلوي، والتي من شأنها الحفاظ على توازن البروتين لتجنب اضطراب ثانوي لديناميات المجمعات الجزيئات تنظيم التغييرات خلية الشكل . وبالتالي من الناحية المثالية، يجب أن يتم تنفيذ استنفاد إضافة الخلفي من الجينات في المصالح في وقت واحد.
وقد وصفت استخدام المجمعات من اتش مع البوليمر الموجبة أو الدهون لتعزيز نقل الجينات في المختبر والمجراة 11،12. على سبيل المثال، يظهر فوسفات الكالسيوم (التعريب) لتشكيل يعجل معاتش التي تعزز فيروس ملزم دخول عبر مستقلة CAR المسار 13. في الواقع، وجدنا أن الجمع بين القائم اتش تنبيغ الخلية وترنسفكأيشن مع المركبات الموجبة يمكن أن تعزز كفاءة التجارب استنزاف الانقاذ. وهذا ما سمح لنا لخفض كميات الفيروس عن طريق 3- إلى 20 أضعاف، اعتمادا على خط الخلية والجينات في المصالح، والاستفادة من نافذة أوسع من أجل ضبط التعبير عن البروتينات الخارجية في المستويات الخفية تقريبا في غالبية من سكان الخلية في المصالح مع الحد الأدنى من التأثير على التشكل الخلوي. في ظل هذه الظروف، يمكننا أيضا تحقيق درجة عالية من الكفاءة ضربة قاضية للتعبير البروتين الذاتية (> 75٪). وصفنا بهذا الخطوة طريقة خطوة، وتقديم أدلة على أن توازن البروتين ليست منزعجة بشكل كبير وفقا لتقييم مستويات دون تغيير من المحرمين التوتر الناجم عن الأسرة البروتين الحرارة صدمة، مما يجعل طريقة مناسبة للتحليلات وظيفية رو الفسيولوجيةلو من الجزيئات المصاحبة التي كتبها الوقت الفاصل بين المجهري الفيديو. البروتوكول هو قابل للإجراءات تزامن انقسام الخلية واستخدام baculoviruses المتاحة تجاريا للمشاركة في التعبير عن مستويات منخفضة من علامات الفلورسنت، مع الحد الأدنى من التدخل في ديناميات القائم على الأكتين والمغزل العادية خلال التقدم الإنقسامية. وتبين لنا كذلك براعة الأسلوب، والتي تنطبق على "من الصعب تنبيغ" خلايا C2C12 الماوس، مع عدم وجود تأثير كبير على التمايز بالخلايا العضلية الجذعية في myotubes في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، وصفنا طريقة تمكين التجارب استنزاف الانقاذ التي يتعين القيام بها، والتي تنطبق على تحليلات وظيفية عمليات الخلية البيولوجية التي هي حساسة بشكل خاص للoverexpression من البروتينات التي تؤثر على العناصر المتفاعلة وديناميات البروتين المجمعات والمنشآت الجزيئات. انقسام الخ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research (Grant no 7077), and by the Bellini Foundation and Roby Fondazione.
Materials
| C2C12 Mouse Myoblasts | ATCC | CRL-1772 | |
| Adenovirus custom design | Welgen | Custom design | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10582 | |
| CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher | C10614 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher | 12483-020 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Glass bottom dishes, 35mm | MatTek Corperation | P35G-1.5-20-C Case | |
| HeLa-RFP-H2B | Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada | Klebig C et al. 2009 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| Horse Serum, New Zealand | Thermo Fisher | 16050-122 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher | 13778-150 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha | Wisent | 310-101-CL | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides | Thermo Fisher | 12000-022 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red | Thermo Fisher | 41061-029 | |
| Na2HPO4 | Biobasic | S0404 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher | 11058-021 | |
| rAVCMV-LifeAct-TagGFP2 | IBIDI | 60121 | |
| siRNA duplexes | Dharmacon | Custom design | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Trypsine 2.5% | Thermo Fisher | 15090-046 |
References
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
- Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts. J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).
- Yousuf, M. A., et al. Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells. PLoS One. 8 (10), e77462 (2013).
- Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. Sci Rep. 3, 2889 (2013).
- Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).
- Fuchs, M., et al. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).
- Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2, e141 (2011).
- Guilbert, S. M., Tanguay, R. M., Hightower, L. E., et al. . The Big Book of Small Heat Shock Proteins. , 435-456 (2015).
- Fasbender, A., et al. Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).
- Toyoda, K., et al. Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery. Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).
- Fasbender, A., et al. Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo. J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).
- Fuchs, M., et al. A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis. PLoS Genetics. 11 (10), e1005582 (2015).
- Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain. J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Takahashi, A., et al. Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).
- Murray, T. V., et al. A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation. J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).
- Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells). Int J Cell Biol. 2013, 616294 (2013).
- Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion. Sci Signal. 6 (272), re2 (2013).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
